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人脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的克隆及在HeLa细胞中表达的研究

刘慧  扈廷茂  刘明秋  
【摘要】:根据已知人脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad gene,FHIT)基因的 mRNA 序列,RT-PCR 得到一段493bp 的 FHIT cDNA 序列,将其构建到 pMD18-T 中扩增,经限制性内切酶切割,回收目的片段分别插入双顺反子表达载体 pIRES2-EGFP 和融合表达载体 pEGFP-C1 的多克隆位点(MCS)中,构建成表达载体 pIE-FHIT 与 pEC1-FHIT。经酶切及 PCR 检测。分别将检测正确的双顺反子表达载体以脂质体介导方式转染 HeLa 细胞,48h 即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。利用 G418筛选稳定转染的细胞,提取总 DNA,经 PCR 检测证明 FHIT 基因已稳定整合到细胞基因组中。RT-PCR 检测。表明其在转录水平得到表达。对转染细胞免疫细胞化学检测显示,转染细胞的胞浆呈棕褐色,而阴性对照细胞的胞浆没有特异性染色;以苏木素对细胞核进行复染,呈监色。在显微镜下观察到转入 FHIT 基因的细胞核被深染并出现固缩。而阴性对照组的细胞核早浅染,形状较规则,体积也较大。TUNEL 法检测结果表明,转染重组质粒的细胞大多数细胞核发生固缩,形状不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒状。与阴性对照比较可见 FHIT 基因具有促进细胞凋亡的作用,并且 pEC1-FHIT 中 EGFP 和 FHIT 融合表达并未改变 FHIT 的功能,因此也证明了引入报告基因的 FHIT 载体构建成功。本研究通过向缺失 FHIT 蛋白的 HeLa 细胞中转入 FHIT 基因,在分子和细胞水平证明了其促进凋亡的功能,从而支持了 FHIT 为一抑癌基因的观点,对抑癌基因的进一步研究和基因治疗的应用具有重要意义。

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