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《2010·第一届斑马鱼学术研讨会论文摘要集》2010年
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通过以斑马鱼为模式的遗传筛选研究脊椎动物细胞分化与发育

佟向军  夏梽丹  祖尧  Helena Telfer  胡婧  于静怡  刘欢  张泉  苏都莫日根  林硕  张博  
【摘要】:斑马鱼是用遗传学手段在个体水平上研究细胞增殖与分化的理想模式脊椎动物。我们通过To/2转座子介导的增强子诱捕以及假型反转录病毒介导的插入诱变,在斑马鱼中开展了大规模组织特异性表达的基因与突变体的筛选,获得了1,700多个在各种组织中特异表达荧光蛋白(GFP或RFP)报告基因的鱼系和600多个潜在的基因突变。从上述突变体库中,我们筛选出了一株脊索结构发生缺陷的突变鱼系v-835-2。脊索是脊索动物门的特征性结构,它在脊椎动物的胚胎发育、图式形成以及胚胎运动中具有重要作用。野生型斑马鱼胚胎的脊索表面光滑、折光性强,主要含有两类细胞:内部由终末分化的、如硬币样堆叠的较大的单层泡状细胞(chordocyte)构成,外面包绕着一层较小的、分化程度较低的上皮细胞,或称鞘细胞(chordoblast)。v-835-2突变体中反转录病毒的插入位点位于一个未报道过的新基因的第一个外显子中,脊索从胚胎受精后30小时开始在局部出现破碎,随后扩散到整个脊索,最终导致脊索在光镜下呈现表面粗糙的颗粒状结构。我们将该突变体及其相关基因命名为"ngs"(notochordgranularsurface)。该基因编码的蛋白产物在氨基酸水平上跟非洲爪蟾的Des蛋白相比有54%的同源性,跟斑马鱼、小鼠和人的Vimentin或Desmin相比具有40%的同源性,显示该蛋白属于中间纤维蛋白家族的一个新成员。整体胚胎原位杂交结果表明,该基因特异地在脊索中表达。RT-PCR结果显示,病毒序列的插入造成该基因的mRNA水平明显降低。通过向单细胞期胚胎注射morpholino敲低ngs基因的表达,能够模拟出跟突变体相同的脊索异常表型。注射ngs体外合成的mRNA,或以泛表达的启动子xex驱动的ngs转基因斑马鱼,都能够挽救突变体胚胎的脊索异常表型。显微形态观察以及DNA含量分析结果表明,呈现颗粒状表型的突变脊索内部的泡状细胞消失,代之以许多分化程度较低的小细胞;这些小细胞很可能由脊索上皮细胞增殖而来。在透射电镜下观察受精后48小时的斑马鱼胚胎超薄切片,发现野生型脊索泡状细胞中存在大量直径约为10nm的中间纤维状纤维结构,而突变的脊索细胞中则缺乏这些纤维。经麻醉处理、无法运动的突变体胚胎的脊索很少出现结构异常的表型;用毛细玻璃针人为刺破少量的脊索细胞后,可出现跟ngs突变体类似的表型。上述结果表明,ngs突变体胚胎运动产生的机械压力很可能造成了脊索泡状细胞的破碎,导致脊索上皮细胞增殖以填充脊索内的空腔,从而使脊索出现"颗粒化"的表型。ngs基因产物很可能通过参与中间纤维网络的形成维持脊索泡状细胞结构的稳定性,使脊索能够对斑马鱼幼体的运动起到重要的支持作用。我们的结果揭示了中间纤维类蛋白在维持细胞结构中的新功能,同时体现了将斑马鱼用于在个体水平上研究细胞增殖与分化的优越之处。

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