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《中国细胞生物学学会医学细胞生物学学术大会论文集》2006年
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SHV-4型ESBL的表达纯化及其特性研究

王震  叶明君  邹立林  季敬璋  陈秀枢  吕建新  
【摘要】:目的:在pET26b/BL21(DE3)表达系统中,表达纯化SHV-4型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum-beta-lactamase,ESBL),纯化后的SHV-4酶进行特性研究, 最终为临床用药提供借鉴及其满足各领域对纯酶的需求。方法:将SHV-4基因克隆到表达载体pET26b中,构建pET26-SHV-4表达质粒,再将重组质粒转入大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)中,挑取10个较大克隆,扩增提取质粒,酶切鉴定, 并选取对头孢硝噻吩降解速度最快的一个克隆为原始菌,37℃时,摇瓶发酵获得种子菌,再转入发酵罐发酵,当菌体生长至OD600nm0.8 A时,加入诱导剂异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L,6h后离心收获细菌并超声裂解,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达形式为可溶性表达,离心超声裂解液, 对超声上清进行Ni2+亲和层析,获取的SHV-4酶再进行SDS-PAGE电泳及其活性的鉴定,最后对SHV-4纯酶进行等电点、动力学参数等酶特性测定,并在不同的 pH和温度时测定SHV-4酶的活性。结果:酶切质粒表明10个克隆都成功转入目的基因,活性最高的菌株纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析及其活性鉴定表明,该蛋白为SHV-4酶,分子量约为30kD,纯度大于95%,等电点为5.9,最适pH值为6-8,最适温度为37℃,以头孢硝噻吩为底物Km值为2.61×10-6M/L, Kcat为258 S-1,Kcat/Km为9.88×107M-1S-1L。结论:成功的表达有活性SHV-4酶, 该酶有广泛pH、温度适应能力,有望开发成为商品酶。

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