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怀牛膝毛状根转化系的建立及其齐墩果酸含量的分析

郝瑞文  贾敬芬  林雪  郝建国  
【摘要】:正怀牛膝(Achyranthes bidentata B L.)是苋科牛膝属植物,我国著名四大怀药之一。其主要活性成分之一是齐墩果酸,具有保肝、抗炎、利尿、降血脂、强心及增强免疫等功效。本研究用发根农杆菌 A4、9402Bin19和ATCC15834三个菌株分别感染怀牛膝组培苗的叶切片和茎段,在无外源激素的 MS培养基上培养获得了毛状根转化系。以ATCC15834菌株介导转化叶片外植体效果最好,转化率在80%以上。在1/2MS培养基中进行液体振荡培养,毛状根在20天内鲜重增达28g/L,为接种量的 5.8倍,25天时达到最大值,增长8倍多。经高压纸电泳法检测显示毛状根转化系具有合成特异产物甘露碱的特性,说明TR-DNA上的甘露碱合成酶基因已整合到毛状根细胞中。根据ro1B基因序列设计引物,进行PCR扩增反应,从ATCC15834菌株质粒和转化的毛状根总DNA中扩增出了564bp 特异片段,证明TL-DNA上的rolB基因整合到了毛状根基因组中。用HPIC方法测定了ATCC15834 菌株转化的毛状根中的齐墩果酸含量,发现该根系液体培养20天时,其齐墩果酸的含量可达 25.59mg/g.DW,是栽培牛膝一年生根含量(14.73mg/g.DW)的1.74倍。对ATCC15834菌株转化的毛状根系还进行了进一步的植株分化条件研究,发现在附加1.5mgL-12,4-D,0.5mgL-16BA的MS培养基上培养两周后,可从毛状根切段诱导出愈伤组织。当这种愈伤组织转移到附加有1.0mgL-16BA 和0.5mgL-INAA的MS培养基上培养后产生了丛生芽。切取丛生芽接种于附加1.0mgL-1IBA的MS 培养基后,诱导了根的分化,并获得再生苗。分析表明,毛状根的愈伤组织和再生植株仍具有转化特征。以上研究为利用毛状根转化系进行牛膝药用成分生产奠定了实验基础。牛膝毛状根的离体培养和植株再生体系的建立对于向该种植物导入有用基因以及遗传改良具有技术参考意义。

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