收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

SARS病毒RdRp基因系列真核表达载体的构建及细胞株的建立

王刚  张义正  
【摘要】:正目的获得表达SARS病毒RDRP(RNA dependent RNA polymerase)和标记蛋白GFP(Green Fluorescent Protein)的系列真核表达载体,并建立相应的细胞株。方法建立了3类表达载体:1、单独表达RdRp和gfp基因的载体:以pcDNA3.1(+)为载体构建了pcDNA-RDRP(简写为pcDNA-R, 以下同)和pcDNA-GFP(pcDNA-G);2、融合表达载体:以pcDNA3.1(+)为载体构建了 pcDNA-GFP-RDRP(pcDNA-GR)和pcDNA-RDRP-GFP(pcDNA-RG),以pEGFP-C1为载体,在不同位置插入RdRp基因,构建了pEGFP-CR1和pEGFP-CR2;3、双顺反子表达载体:以pcDNA3.1(+) 为载体,利用pIRESneo载体的IRES元件,构建了pcDNA-GFP-IRES-RDRP(pcDNA-GIR)和 pcDNA-RDRP-IRES-GFP(pcDNA-RIG)。将以上载体分别导入VERO E6细胞中进行研究,分析其转录及表达情况,观察荧光强度及靶蛋白的亚细胞定位,并分析载体在细胞染色体上的整合情况,筛选、纯化以建立几类稳定表达靶基因的细胞株。结果除pcDNA-R外,倒置荧光显微镜观察,可见各个载体均能在VERO E6细胞中表达不同荧光强度的靶蛋白,其荧光强度由大到小依次为 pcDNA-G、pEGFP-CR1和pEGFP-CR2、pcDNA-GIR、pcDNA-GR、pcDNA-RG和pcDNA-RIG。RT-PCR 分析显示,所有载体均在VERO E6细胞中转录出预期大小的mRNA;以GFP抗体进行Western blot 分析,可见各载体表达的蛋白质与预期大小一致;以各种细胞的基因组DNA为模板进行PCR分析, 可见载体已整合到细胞的基因组中。通过G418筛选结合胰酶定点消化等方法,分选、纯化进而建立了几种由单个细胞形成的细胞株:VERO-RDRP,VERO—GFP,VERO-GR和VERO-GIR。以上细胞株在低强度选择压力(200-300μg/mL G418)下,能够长期稳定表达绿色荧光蛋白。pEGFP-CR1 和pEGFP-CR2难以整合到细胞的染色体上,但其较强的荧光对瞬时表达研究非常有利。结论获得了带GFP标记、表达SARS病毒RdRp基因的多种类型真核表达载体,并建立了各种类型的代表性细胞株,为进一步研究奠定了基础。

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 武卫华;孔璟;叶彬;;hsa-mir-373对肿瘤细胞中E-钙黏蛋白表达的影响[J];生物技术通报;2011年08期
2 李彩艳;王凡;王崎;;pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定[J];包头医学院学报;2011年03期
3 林月霞;吴志坚;袁茵;董斌;田素娟;;人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达[J];广东药学院学报;2011年04期
4 白立景;鞠辉明;牟玉莲;杨述林;李奎;陈明勇;;大肠杆菌植酸酶appA2基因真核表达载体的构建及在细胞中的表达[J];中国兽医杂志;2011年07期
5 吴健谊;蒋太峰;谢剑君;张锴;杜则澎;许丽艳;;哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达[J];癌变·畸变·突变;2011年04期
6 赵萌;徐青;于继云;余云舟;;一种拮抗HIV-1并靶向DC的融合基因的设计及表达鉴定[J];生物工程学报;2011年08期
7 沈培;郑东;刘艳;田洁;赵银霞;刘青玲;朱晨露;马洁;苏兆亮;马斌;许化溪;王胜军;;小鼠GITR真核表达载体的构建及表达[J];江苏大学学报(医学版);2011年04期
8 徐文琦;柴晓杰;张婷;代靖宇;张晓琳;;胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因新型真核表达载体的构建及其在盐藻中的表达[J];中国生物工程杂志;2011年08期
9 张文帅;卞倩;迟莹;温恬;李燕;焦永军;;甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体的构建与表达[J];现代预防医学;2011年16期
10 张瑶楠;石冲;马永超;王泽生;张玉祥;;c-Src结构域真核表达载体的构建及鉴定[J];河南大学学报(自然科学版);2011年05期
11 袁子国;王晓虎;徐慧娟;张守峰;扈荣良;张秀香;;狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区真核表达载体的构建及其在DK细胞中的表达[J];中国畜牧兽医;2011年06期
12 刘应兰;杨靖;钟警;曹仁贤;;S100A13基因的高表达对HepG2细胞生物学性状影响的研究[J];中国现代医学杂志;2011年16期
13 顾卉;佟宇鑫;刘彤;李妍;李丹妮;袁正伟;;hLMO3基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位[J];解剖科学进展;2011年04期
14 李育中;范静;沈霏;王建光;杨菊芬;吕琦;马海英;夏光敏;陈穗云;;“Anti-UV Clone”柴胡细胞提取物对UV-B照射HaCaT细胞的影响[J];云南大学学报(自然科学版);2011年04期
15 吴建勇;易小萍;张元兴;孙祥明;;稳定表达重组长效促红细胞生成素的CHO-K1细胞株的筛选[J];中国生物制品学杂志;2011年08期
16 李丽泉;任铁玲;叶柳青;刘弢;胡前胜;;神经细胞粘附分子在不同细胞株转染表达效果的比较[J];中国卫生检验杂志;2011年08期
17 张丽星;张喜珍;王玉倩;刘晨露;夏秋;孔维;于湘晖;张海红;;双顺反子表达载体DV的构建及其表达效率[J];中国生物制品学杂志;2011年09期
18 郭玉萍;赵洪涛;王玮;张世庆;李澜;李恩中;李德雪;;小鼠Bmi1基因的克隆及其在支持细胞中的表达[J];天中学刊;2011年05期
19 周颖;侯树勋;衷鸿宾;;RNF185的克隆及过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响[J];军事医学;2011年06期
20 杜雪;张东;周欢敏;;CMV启动子指导pDsRed2-1基因在牛胎儿成纤维细胞中的表达[J];内蒙古农业大学学报(自然科学版);2011年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王刚;张义正;;SARS病毒RdRp基因系列真核表达载体的构建及细胞株的建立[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年
2 肖希斌;谢兆霞;;shRNA表达载体逆转K562/A02细胞多药耐药的研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年
3 李乐军;曹开源;吴荣佩;刘雷;刘辉;李晓飞;;RNAi沉默G250/MN/CAIX基因对肾癌Ketr-3细胞株生物学行为的影响[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
4 赵永波;吴云成;;Nurr1 shRNA表达载体的构建及其对多巴胺能细胞内源基因的干扰作用[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
5 刘伟;单保恩;艾军;宋小天;马鸣;;转染Syk基因对MDA-MB-231乳腺癌细胞株IL-2受体表达的影响[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
6 吴金明;黄智铭;吴建胜;陈向荣;林菊生;;MxA基因真核表达载体构建及体外抗HBV作用研究[A];浙江省中西医结合学会消化专业第八次学术年会暨省中西医结合消化系疾病新进展学习班论文汇编[C];2007年
7 吴金明;黄智铭;吴建胜;陈向荣;林菊生;;MxA基因真核表达载体构建及体外抗HBV作用研究[A];2007年浙江省消化系疾病学术会议论文汇编[C];2007年
8 尹郸丹;梁英民;韩骅;侯丽宏;王耀春;胡兴斌;张萍;康志杰;时宏伟;;RBP-J与KyoT2真核表达载体的构建与鉴定[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
9 郭鹏;闫承慧;郭亮;康建;韩雅玲;;小鼠E1A激活基因阻遏子RNA干扰表达载体的构建及鉴定[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年
10 杨英;刘树铮;;pNEgr-mIL-12真核表达载体的构建及其在体外和体内生物学活性的检测[A];中华医学会放射医学与防护学分会第三次全国中青年学术交流会论文汇编[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭凯文;ASAP3对人肝癌细胞侵袭转移能力的影响[D];华中科技大学;2011年
2 蔡丽敏;肿瘤抑制基因ING4对黑素瘤细胞株M14生物学行为影响的体外实验研究[D];中国协和医科大学;2008年
3 彭向红;药物泵(PgP、MRP,LRP)在人SCLC癌组织中的表达及反义MRP RNA对耐ADR人SCLC细胞株耐药性的调节[D];中国协和医科大学;2000年
4 蔺会云;一条新的转移相关基因mag-1的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
5 衡伟;肺癌内皮细胞蛋白C受体的表达及意义[D];苏州大学;2007年
6 袁红艳;人源阳离子抗菌肽hCAP-18/LL-37的基因克隆与真核表达及其对树突状细胞分化成熟的影响[D];吉林大学;2007年
7 魏枫;突变减毒志贺样毒素Ⅰ用于抗肿瘤的应用基础研究[D];天津医科大学;2007年
8 张守纯;p16真核表达载体的构建及其转基因的研究[D];中国医科大学;2004年
9 时杰;WNT5A调控β-连环素蛋白的表达及其机制研究[D];华中科技大学;2007年
10 马水根;IL-24对上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生物学的影响研究(临床前研究)[D];中南大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王勇;RASGRF2真核表达载体构建、肺癌稳定细胞株建立及功能的初步研究[D];重庆医科大学;2012年
2 宋晖;KAI1基因真核表达载体的构建及其对卵巢癌细胞侵袭抑制作用的体外研究[D];第四军医大学;2004年
3 左国伟;人乳头瘤病毒11型E6基因的克隆、真核表达及其功能的初步研究[D];重庆医科大学;2005年
4 涂亦娴;猪瘟病毒E2基因的克隆及其DNA疫苗免疫效果的研究[D];新疆大学;2005年
5 周丹;猪细小病毒SC1株VP2基因表达载体的构建及其表达的研究[D];四川农业大学;2005年
6 李一冬;hTERT真核表达载体的构建与表达[D];郑州大学;2005年
7 李强;重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体A7基因真核表达载体的构建[D];延边大学;2006年
8 王青;新城疫病毒F基因在真核及原核表达系统中的表达[D];西北农林科技大学;2007年
9 许子志;乳腺癌细胞Id1 miRNA真核表达载体构建转染及对MMP9的影响[D];福建医科大学;2009年
10 张惠菊;人自身抗原U1RNP-70K的酵母重组表达及其抗体检测斑点免疫金渗滤法的建立[D];福建医科大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 吴一福;首次成功分离出HPA全长编码基因[N];中国医药报;2005年
2 记者 王心见;加培育出胚胎干细胞株[N];科技日报;2005年
3 吴一福;第四军医大学培养出人胎盘绒毛滋养细胞株[N];中国医药报;2007年
4 吴一福;川大成功建立人新基因PCIA1细胞株[N];中国医药报;2006年
5 ;1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达[N];中国医药报;2003年
6 吴一福;首次获得两株转移潜能不同的骨肉瘤细胞株[N];中国医药报;2005年
7 吴一福;华中科大构建成功脑啡肽星形胶质细胞株[N];中国医药报;2006年
8 张中桥;反义Cortactin基因能抑制肝癌细胞转移[N];中国医药报;2006年
9 张中桥;Survivin是脑胶质瘤基因治疗的良好靶点[N];中国医药报;2006年
10 河南中医学院艾滋病研究所 李伟彭勃 刘景超 等;扶正排毒片水提取物可抑制HIV—1病毒活性[N];中国中医药报;2007年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978