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《中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集》2005年
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运用cDNA-AFLP技术鉴定不同方法合成的cDNA指纹图谱

史胜青  张守攻  李春秀  汪阳东  齐力旺  
【摘要】:正在植物基因克隆以及构建cDNA文库时,都需要合成高质量的双链cDNA,并要达到一定的数量。然而分子实验中经常会受到试验样品量的限制,特别是比较稀少的植物材料,如植物根尖、茎尖或花的雌蕊、雄蕊等,难以获得足够量的RNA,以致影响cDNA的合成量,无法开展下游研究。针对这一问题,利用以PCR为基础合成第二链cDNA的Smart技术(Clontech,Smart cDNA library construction kit,LD-PCR),能够以50 ng的总RNA为反转录模板合成足够的高质量双链cDNA。但研究者对第二链采用PCR方法是否有基因信息丢失或丰度发生变化的程度仍存有疑虑。针对以上问题,本研究通过传统的置换合成和LD-PCR两种方法,合成3个月的梭梭幼苗茎尖双链cDNA。经过EcoRⅠ和MseⅠ限制性内切酶双酶切,PCR预扩增后,以16对选择性扩增引物进行扩增,引物对为EcoR Ⅰ-CA/TG(5’GAC TGC GTA CCAATT CCA/TG 3’)分别与Mse Ⅰ-NN(5’GAT GAG TCC TGA GTAANN 3’,NN分别为AC、AG、CA、CT、GA、GT、TC和TG)组合。选择性扩增PCR产物在5%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,然后进行银染,Olympus数码相机照相。用 ONE-Dscan软件对两种方法合成的cDNA进行cDNA-AFLP的指纹图谱统计分析。结果表明,置换合成和LD-PCR两种方法合成的cDNA指纹图谱中,分别有条带495条和470条;其中,相同的条带共计433条,不同的条带分别有62条和37条,依次为总指纹数的12.5%和7.87%。相同的指纹信息约87%以上。说明两种方法合成的cDNA存在着较大的差异,不同合成方法对cDNA的合成质量影响较大。因此,尽管两种方法合成的cDNA指纹信息绝大多数相同,但使用何种方法,一方面应根据样品的量决定,另一方面更应该根据试验所要达到的目的决定。另外,在操作过程中应该尽可能减少人为误差来弥补试验方法上的不足。总之,本试验为研究人员进行分子实验时,采用何种方法合成双链cDNA提供了借鉴。

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