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《中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集》2005年
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牙鲆肠道乳杆菌新种L15表面粘附蛋白的初步研究

陈营  王蕾  杨桂文  袁金铎  安利国  
【摘要】:正益生乳酸菌在肠道中的定植能够排斥外来病原菌的入侵,从而起到生物抗菌的作用。粘附过程是乳酸菌定植的第一步,菌体表面的各种粘附相关成分是介导粘附的基础,对这些成分的研究分析是阐明益生菌粘附机制的关键,对于应用益生菌调控消化道微生态环境以及进行病原菌的生态防治均具有重要意义。本文以从健康牙鲆肠道中分离筛选的乳杆菌新种L15为实验材料,对其参与粘附过程的表面蛋白质成分进行初步的分离、鉴定和纯化。实验表明,乳杆菌L15在37℃液体MRS培养基中,于6-18h进入对数生长期。通过不同提取方法、不同培养时间、培养温度和培养基盐度实验的比较,在MRS培养基中,37℃静置培养16h 后,利用5mol/L中性氯化锂能够提取到种类和数量都相对较多的L15表面蛋白成分,在提取表面蛋自之后,L15对牙鲆肠粘液的粘附能力有明显地下降。采用蛋白质印迹法(Western blottinK)鉴定L15中参与粘附的表面蛋白质成分,牙鲆肠道粘液经酯化生物素(B-NHS)处理后,与转移到硝酸纤维素膜上的L15表面蛋白质共同孵育,再经过与辣根过氧化物酶标记的亲和素(HRP-Avidin)的作用,DAB显色后显示只有一种蛋白质参与菌体表面的粘附作用,分子量为61.8kDa,将之命名为MAPPpo1。运用亲和柱层析法进行L15表面粘附蛋白MAPPpo1的纯化。首先将牙鲆肠道粘液与溴化氰活化的Sepharose-4B偶联,取L15菌体全蛋白上Sepharose-4B柱并在4℃下孵育过夜,用PBS洗涤掉非特异性吸附的菌体蛋白后,利用含0.1mol/L氯化钠和10mM PBS(pH7.4)的洗脱液洗柱,获得单一的蛋白质吸收峰。蛋白质印迹结果表明,此吸收峰中只含有一种蛋白质成分,即表面粘附蛋白 MAPPpo1。

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