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《第八届中国畜牧科技论坛论文集》2018年
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利用CRISPR/dCas9融合系统激活家蚕基因的表达

汪小刚  马三垣  常珈松  施润  王若琳  赵萍  夏庆友  
【摘要】:引言:近几年来火热的CRISPR/Cas9基因编辑技术使得在哺乳动物细胞和一些多细胞生物中无需通过克隆目的基因的cDNA或打断其基因组序列,而重新编程目标基因表达成为可能。我们之前的研究表明,Cas9以及CpfI可以在家蚕细胞和个体中诱导目的基因序列的突变、缺失、倒置和重复。然而,基于突变失活的CRISPR/dCas9激活(CRISPRa)系统是否同样可以用于家蚕基因功能研究中尚不清楚。材料与方法:为了验证这一系统在家蚕中的可行性,我们首先将来自于酿脓链球菌属的spCas9蛋白的D10A和H840A两个位点突变,获得只有结合能力而没有切割活性的dCas9蛋白,同时在dCas9蛋白后面分别连接了2个激活结构域,包括VP64(VP16转录激活域的四聚体)和VPR(由VP64、p65和Rta三部分激活结构域组成),形成dcas9-VP64和dCas9-VPR,并通过增强型的A4启动子驱动这一系统的表达。其次,我们在选取的目的基因转录起始位点上游200bp以内共设计三对不同位点的sgRNA。我们将dCas9蛋白和sgRNA共转入家蚕BmE细胞中。结果与讨论:实验结果表明,两种激活系统都能引起家蚕细胞内源基因的激活表达,且dCas9-VPR系统的效率要比dCas9-VP64要高,进一步的分析发现,基因上调能力与基础表达水平呈负相关,也就是说对于低表达量的基因,激活效果更明显。而对于已经有转录活性的基因,则较难的有更高的激活表达。同时,我们还证明了这一系统在家蚕中的激活具有很高的特异性。此外,我们还成功地将该系统用于多基因的共同上调表达中,所选取的3个不同的靶基因都能同时获得不同程度的上调。CRISPRa系统相比传统的转基因过表达要简单快速的多,尤其是对于一些高度重复序列和长片段的基因。同时,CRISPR/Cas9相对于锌指核酸酶(ZF)以及转录激活效应因子(TALE)在构建成本上都要高效便宜很多。因此这一技术得到了极大地推广。我们也发现CRISPRa激活系统在家蚕中对于不同的基因的激活效率也不是一致的。同时,sgRNA位点的选择也很大程度上地影响了激活效率。这就需要我们在选取sgRNA位点的时候也可能不止局限于转录起始位点上游200bp以内,可以适当的扩大打靶区域。综上所述,我们的结果证明了CRISPRa激活系统可以成为一种强有力的工具来研究家蚕和其他一些非果蝇昆虫的基因功能。

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