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《中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集》 2011年
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巨型艾美耳球虫免疫原性相异株间差异表达基因消减cDNA文库的构建与分析

刘丹丹  李建梅  韩宏晓  王尚尚  曹李琴  许金俊  陶建平  
【摘要】:为了探索巨型艾美耳球虫上海株和南通株球虫在免疫原性上差异的分子基础,分别以上海株未孢子化卵囊cDNA为试验组,南通株未孢子化卵囊cDNA为驱动组,或相反,以南通株未孢子化卵囊cDNA为试验组,上海株未孢子化卵囊cDNA为驱动组,分别构建了2个抑制性消减文库。随机从两个消减文库中挑取阳性克隆,用接头引物Nest PCR primer 1和Nest PCR primer 2R进行PCR扩增,经PCR鉴定显示,上海株和南通株未孢子化卵囊消减cDNA文库的重组率分别为95%(284/300)和89%(231/261),差异基因片段大小分布在0.25 kb~1.0 kb之间。随后,用地高辛标记方法制备了4种探针,即上海株消减组cDNA探针、上海株未消减组cDNA探针和南通株消减组cDNA探针、南通株未消减组cDNA探针。分别用同源株消减组探针和异源株未消减组探针对同一克隆进行检测,筛选差异表达克隆。在被检测的515个克隆(上海株284个,南通株231个)中,共获得86个差异表达克隆,其中上海株63个,南通株23个。对差异表达克隆测序和同源性比对,共获得10个重叠群(Contigs),其中上海株6个,南通株4个。通过BLAST分析,上海株的6个contigs中5个见有同源序列,1个未见同源序列,可能为新基因;南通株的4个contigs中3个见有同源序列,1个未见同源序列,可能为新基因。最后,选取6个差异表达基因,根据其序列分别设计引物,进行RT-PCR检测,结果发现这些基因在两个虫株内均有表达;随后又从RT-PCR验证的6个差异表达基因中选取2个基因,重新设计引物进行实时定量PCR验证,结果显示这2个差异表达基因在SH株和NT株中确实存在着表达量上的差异。

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