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《中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集》2011年
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基于秀丽隐杆线虫IRES序列双框共表达载体的构建

李镝锐  汪明  
【摘要】:秀丽隐杆线虫(C.elegans)作为模式生物在生物医学研究领域起到了非常重要的作用,亦被认为是一个合适的生物反应器用来表达寄生线虫的疫苗候选分子,这就需要获得稳定的转基因虫系。目前获得秀丽线虫转基因表达虫系主要是通过目的基因与报告基因共显微注射来产生,不过通过此方法,经常得不到重组体,原因可能是两个质粒互相干扰而影响其表达,也许单质粒筛选系统可以解决这个问题。内核苷酸结合序列(IRES)可以吸引真核核糖体翻译起始复合体而独立地起始翻译。生物信息学家预测了在秀丽线虫热激蛋白3(Hsp3)伴侣分子翻译起始点上游存在着一段IRES基序,它具有Y形双发夹结构。然而,目前还没有实验证实它的作用。(目的)本研究旨在用实验验证秀丽线虫Hsp3翻译起始点上游285bp片段是否可以作为IRES序列共表达两个基因,从而构建用于秀丽线虫的双框共表达载体。(方法)在我们的研究中,我们首先把这段从秀丽线虫基因组上扩增出来的IRES序列连接到T载体上,利用T载体上的酶切位点在其上游连接RFP基因,在其下游连接GFP基因,最后把RFP-IRES-GFP片段构建到L3786表达载体上。通过显微注射转基因操作把质粒注射到线虫性腺,对通过镜检表现为荧光阳性的重组体进行PCR,RT-PCR分析重组虫体是否含有RFP及GFP基因,使用GFP抗体对其进行Western blotting分析,检测IRES下游GFP是否有表达。(结果)结果验证L3786/RFP-IRES-GFP这个载体可以在1et-858启动子下同时表达红荧光蛋白和绿荧光蛋白基因两个独立的开放性阅读框。(结论)因此我们首次验证了秀丽线虫细胞中含在IRES序列,并且基于此序列构建了双框共表达载体,为以秀丽线虫为研究模型的实验室提供了一个新的有力的工具,为解决两质粒共转基因表现出来的干扰问题奠定了基础。
【作者单位】:中国农业大学动物医学院国家动物原虫实验室
【分类号】:S852.731

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