收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

猪圆环病毒2型SYBR-Green 1实时荧光定量PCR检测方法的建立

魏战勇  贾艳艳  陈红英  崔保安  
【摘要】:目的:建立一种快速、灵敏检测猪圆环病毒2型的SYBR-Green 1实时荧光定量PCR方法。方法:根据已报道的猪圆环病毒2型ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增猪圆环病毒2型ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验。结果:结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988;将已计算出拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释,在荧光定量PCR仪上得出所能检出的最低拷贝数为1拷贝/25μL(反应体系浓度),比常规PCR结果高100倍;将猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒阳性样品的DNA作为模板,进行荧光定量PCR检测,结果显示,只有PCV2有荧光信号,其他无荧光信号,说明该方法有很好的特异性;选取10~(-5)倍稀释的重组质粒为模板,连续扩增6次,结果表明,每次扩增的误差不到1个循环,可见荧光PCR检测方法具有较高的可重复性,从而保证了不同样品间检测结果的可靠性和稳定性;对16份疑似PMWS的病料进行SYBR-Green1荧光定量PCR检测,16份完全阳性;常规PCR扩增,检测到13份阳性,说明荧光定量PCR比常规PCR灵敏度高。结论:成功建立了检测猪圆环病毒2型的SYBR-Green 1荧光定量PCR方法,与普通PCR相比,该方法具备许多优点:灵敏度高,可检测到1拷贝/25μL(反应体系浓度)的模板量;特异性强,与其他猪源性病毒无交叉反应;线性范围宽,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数达0.99881所需时间短,从核酸提取至检测完成,仅需3h左右,且该方法实行完全闭管式操作,从根本上杜绝了常规PCR扩增产物污染和假阳性的问题。此方法为早期诊断猪圆环病毒2型起到很好的指示作用,也为下一步研究猪圆环病毒2型在猪体内的分布、致病机理及组织嗜性的研究奠定了基础。

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 杨怡姝;孙晓娜;王小利;沈思嗣;李泽琳;曾毅;;实时荧光定量PCR技术的操作实践[J];实验室研究与探索;2011年07期
2 许黎黎;鲍琳琳;秦川;;季节性流感病毒H1N1实时荧光定量PCR检测方法的建立[J];中国比较医学杂志;2011年07期
3 阎赟梦;李庆华;李杰;柴丹丹;薛乐勋;;杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析[J];郑州大学学报(医学版);2011年04期
4 吴永彬;肖维威;张宝;蔡翠霞;康文杰;周琳华;刘唐书;马文丽;;转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用[J];中国生物化学与分子生物学报;2011年08期
5 邢楠楠;;分光光度法测定不同钼矿样品及矿渣中钼的含量[J];黄山学院学报;2011年03期
6 马月萍;戴思兰;马艳蓉;;荧光定量PCR技术在植物研究中的应用[J];生物技术通报;2011年07期
7 王娜娜;姚秀清;谢小莉;张全;;凝胶层析法测定蛋白含量的方法[J];应用化工;2011年05期
8 谭冬梅;刘巍;邓丽丽;唐振柱;黄兆勇;方志锋;马宇燕;卓家同;;南宁市散发性腹泻病例中检出GⅡ.12型诺如病毒[J];中国疫苗和免疫;2011年03期
9 苏强强;吴登俊;;绵羊CS-3基因的克隆及其在绵羊不同组织中的表达研究[J];中国畜牧兽医;2011年07期
10 蔺芳;付瑞敏;皮川真;时凯;叶刚;江景玉;陈慧珍;;SYBR Green I荧光检测痕量宿主DNA[J];东北农业大学学报;2011年07期
11 罗薇;张金灵;夏梦芸;刘内生;裴超信;;Ⅰ型鸭肝炎病毒(MY株)活疫苗毒种的纯粹及生产条件探索[J];西南民族大学学报(自然科学版);2011年04期
12 孙会芳;刘占广;张瑞华;翟征秋;;海水中硝酸根的检测与分析[J];盐业与化工;2011年04期
13 邵雪君;陈子兴;缪美华;岑建农;沈宏杰;;基于荧光微球液相基因表达阵列的建立[J];生物化学与生物物理进展;2011年07期
14 陈星;潘迎捷;孙晓红;赵勇;;荧光定量PCR法检测副溶血弧菌tlh和tdh基因的表达差异[J];微生物学通报;2011年07期
15 李华伟;武聚富;庄英华;高飞;吴国娟;;鸡传染性支气管炎病毒M41型的扩繁及在鸡胚肾细胞上的适应性研究[J];北京农学院学报;2011年03期
16 姜金庆;张海棠;范国英;马金友;王自良;王建华;;19-去甲睾酮单克隆抗体的筛选及icELISA方法的建立[J];科学通报;2011年20期
17 王旭静;董雷;苗猛猛;唐巧玲;王志兴;;转豇豆胰蛋白酶CPTI基因棉花检测用标准分子的制备[J];中国生物工程杂志;2011年08期
18 田春波;陈荣富;蓝玉清;柳付明;;一例历史鼠疫患者坟墓中的土壤检测报告[J];中国卫生检验杂志;2011年08期
19 肖蕊;余真真;Elsharawy AA;魏锋;杨家荣;;土壤中棉花黄萎病菌SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR定量检测技术研究[J];菌物学报;2011年04期
20 郭丹丹;姚堃;周锋;李凌云;茌静;王芳;顾斌;张春;;人类疱疹病毒6A对神经细胞的嗜性及细胞周期的影响[J];南京医科大学学报(自然科学版);2011年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 魏战勇;贾艳艳;陈红英;崔保安;;猪圆环病毒2型SYBR-Green 1实时荧光定量PCR检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
2 韩彩霞;赵德明;;实时荧光定量PCR构建PrP基因标准曲线[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年
3 朱远东;徐卫;缪扣荣;朱丹霞;乔纯;刘澎;李建勇;;miR-128、let-7b和miR-223的检测在急性白血病分型中的作用[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
4 邱蜜蜜;孟轲音;丁壮;叶俊青;丛彦龙;李志杰;刘美;李少丽;王昌庆;吴昊;;猪戊型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
5 任伟;杨利峰;赵德明;;实时荧光定量PCR构建朊病相关蛋白P38MAPK标准品质粒和标准曲线[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
6 卢亦愚;;实时荧光定量PCR技术及其在病毒性疾病应急诊断中的应用[A];应对突发公共卫生事件论坛论文集[C];2005年
7 江千里;孟凡义;杨柳;江汕;李冰;宋兰林;冯茹;周淑芸;;bcr-ablP210和abl基因实时荧光定量PCR检测共用质粒标准品的制备及应用[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
8 岑东;吕建新;裴仁治;涂植光;余晓林;文阳安;;实时荧光定量PCR检测急性白血病的肝细胞生长因子mRNA的表达及其临床意义[A];2007年浙江省医学检验学学术年会论文汇编[C];2007年
9 王峰;刘青;王晓伟;陈洪博;于琳琳;王玥;姜艳萍;成子强;;实时荧光定量逆转录PCR检测禽白血病病毒J亚群(ALV-J)[A];中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(下册)[C];2010年
10 张宜瑾;王萍;丛敏;王宇;尤红;贾继东;王宝恩;;实时荧光定量PCR测定大鼠肝脏细胞外基质mRNA水平[A];中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 袁宏;人急性早幼粒细胞白血病的MRD监测及临床应用研究[D];大连医科大学;2007年
2 沈长新;实时荧光定量PCR检测外周血循环肿瘤细胞的研究[D];华中科技大学;2009年
3 林莉;RRM1和mdr1基因单核苷酸多态性及表达的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
4 张丽萍;不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因关系的研究[D];四川农业大学;2007年
5 叶其炎;基于不同探针的几种持久性有毒污染物检测方法研究[D];东华大学;2010年
6 陈晨;盐生杜氏藻Dscbr基因的光保护功能及机制研究[D];四川大学;2007年
7 张晶波;荧光定量PCR检测立克次体[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
8 周见至;孕鼠暴露于炎症、免疫刺激剂诱发子代高血压机制研究:发病相关候选基因的筛选[D];第三军医大学;2007年
9 张翠梅;苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达和向红系分化的研究[D];南方医科大学;2007年
10 江勇;肉仔鸡小肽转运载体的克隆表达及其转运调控研究[D];中国农业科学院;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈坤;一次性静态芯片实时荧光定量聚合酶链反应方法研究[D];东北大学;2008年
2 罗洁;生物传感与实时荧光定量技术检测堆肥微生物酶编码基因的研究[D];湖南大学;2011年
3 马建强;异基因造血干细胞移植人疱疹病毒7型感染的研究[D];北京中医药大学;2011年
4 王伟平;96孔实时荧光定量PCR检测系统的开发[D];浙江工业大学;2011年
5 马飞;极大节旋藻实时荧光定量PCR内参基因的选择[D];中国海洋大学;2012年
6 叶晓艳;实时荧光定量PCR检测肠道病毒方法的建立[D];华中科技大学;2009年
7 薛鹏浩;人博卡病毒和人偏肺病毒核酸检测方法的建立及初步应用[D];西北农林科技大学;2011年
8 程红;实时荧光定量PCR检测MM患者IgH基因重排[D];昆明医学院;2010年
9 张燕;肠癌SW480细胞TLR4与协同刺激分子B7-H3表达的初步研究[D];苏州大学;2012年
10 闫先侠;CEA-mRNA实时荧光定量检测方法的建立及其在结直肠癌患者中的应用[D];山东大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 刘沛国 胡燕苹;广东局3项食品科研项目通过成果鉴定[N];中国国门时报;2006年
2 梁丽朱文达;提高检验能力和信誉成当务之急[N];中国质量报;2007年
3 记者 张平阳 杨斌鹄;快速检测甲流 西安批量生产关键设备[N];西安日报;2009年
4 ;研发甲流检测设备[N];西安日报;2009年
5 季爱华;饲料中牛羊源性成分测定新法通过审定[N];中国食品报;2009年
6 记者 白毅;我国建成高水平药靶筛选技术平台[N];中国医药报;2006年
7 ;饲料中牛羊源性成分测定法标准通过审查[N];中国畜牧兽医报;2009年
8 ;铝塑复合板幕墙工程施工及验收规程(报批稿之三)[N];中国建材报;2007年
9 上海神珠电子器材有限公司高级工程师 朱升和;汞齐紧凑型荧光灯的预热、启动特性及开关试验[N];消费日报;2008年
10 朱小兵;解析气相色谱[N];中国包装报;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978