弓形虫瞬时转染中不同启动子介导的双报告基因优化

【摘要】：在弓形虫外源基因转染研究中,基于弓形虫不同启动子,对叩甲虫荧光素酶和荧光蛋白双报告基因可否在弓形虫转染中实现同时定性和定量检测至今未见尚报道。方法针对弓形虫3个不同启动子GRA1、DHFR和SAG1,构建了一系列荧光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因载体。对弓形虫瞬时转染中影响启动子检测活性的相关条件作了优化。运用荧光倒置显微镜和流式细胞术检测荧光蛋白的表达,用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性,并定量监测载体转染效率。结果倒置荧光显微镜观察和流式细胞术检测的结果均显示,不同启动子趋动荧光蛋白表达的强弱不同。流式细胞术检测结果表明,串连YFP荧光蛋白和GFP荧光蛋白在相同启动子趋动下,前者荧光强度大约是后者的3.9倍。用倒置荧光显微镜监测弓形虫瞬时转染,串联YFP报告基因比GFP报告基因敏感性高。但是,串联DHFR-DHFR启动子构建的载体,与GRA1-DHFR串联及SAG1-DHFR串联启动子所构建的载体相比,前者的荧光素酶活性和荧光蛋白表达强度均比后者要低。定量监测同一载体转染效率,结果表明,不论使用哪种启动子,电转10~5到10~7弓形虫可检测到荧光蛋白表达,而10~4没有检测到荧光蛋白表达;而10~4到10~7弓形虫可检测到荧光素酶的活性。结论本研究成功构建了以串连YFP和荧光素酶为双报告基因的基于弓形虫3个不同启动子(GRA1、DHFR和SAG1)的瞬时转染载体。荧光素酶报告基因的敏感性高于荧光蛋白报告基因。以GRA1和DHFR为启动子建立的双报告基因系统要比以SAG1启动子建立的双报告基因系统,更适宜于基因转染的监测。