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《中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集》 2005年
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犬冠状病毒大熊猫株核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

乔军  夏咸柱  杨松涛  胡桂学  谢之景  闰芳  黄耕  
【摘要】:首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCVDXMV)核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。本实验根据GenBank中报道的CCVlnsavc-1株N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物,对分离的CCVDXMV野毒株进行了RT-PCR扩增。将扩增的PCR产物纯化回收后与pGEM-T连接得到重组质粒pTN,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1146bp,编码382个氨基酸;与CCⅤ标准毒株Insavc-lN基因相比,核苷酸的同源性为92.6%,推导的氨基酸的同源性为93.2%。在推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒N蛋白相应区域相同,推测可能是RNA结合区。预测的DXMV株N蛋白疏水性和抗原表位与Insavc-l株N蛋白存在细微的差异。将pTN双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETN,转化大肠杆茵BL21,用IPTG进行了诱导表达。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为48000的重组蛋白,兔疫印迹法证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的49.3%,表达的蛋白纯化后可用于建立检测大熊猫CCV抗体间接ELISA用的包被抗原。

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