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《中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集》2005年
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猪繁殖与呼吸综合征和猪流感复合RT-PCR诊断方法的建立及应用

夏平安  李艳伍  张红英  杨霞  崔保安  卢中华  
【摘要】:根据猪流感(SIV)A/Swine/HeNan/703/2001(H3N2)株的NP基因保守序列、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCC VR-2332)的ORF6及部分ORF7保守序列,设计合成了两对特异引物:SIV(PS)5’A—GATTAGGGCATCCGTCG3’,(PR)5'CTCAGCATTTCCTGGGTT3’;PRRSV (PS)5’AAAGCCTCGTGTTGGGTG3’,(PR)5'TGAGGGTGATGCTGTGAC3'。分别从SIV感染鸡胚尿囊液和PRRSV感染的细胞培养液中提取病毒总RNA,并利用反转录-聚合酶链反应(RT—PCR),扩增出大小为605 bp和426 bp DNA片断,与预期目的DNA片断大小一致,经酶切鉴定后,亚克隆到pGEM-T载体中测序,经网上序列分析表明,所克隆的SIV DNA片段序列和PRRSV DNA片段序列与参考基因的核苷酸序列同源性分别为99.0%和99.5%;通过优化RT—PCR条件,最终建立了可同时检测PRRSV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,该方法能检出104倍稀释的SIV尿囊液和105倍稀释的PRRSV细胞培养液,与PRRS和SI单一RT-PCR结果一致。用此法分别检测PRRSV和SIV感染猪的血液、鼻腔分泌物样品,最早在第7 d能检出。分别对具有典型临床症状的11头PRRSV病猪、9头SIV病猪、5头PRRSV和SIV混合感染病猪及10头健康对照猪的血液、鼻腔分泌物、肺组织等进行检测,结果11头PRRSV RT—PCR阳性,8头SIV RT-PCR阳性,4头SIV和PRRSVRT—PCR同时为阳性,健康猪对照样品全部阴性。实验结果表明,PRRSV和SIV二联RT-PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,可从分子水平上对SIV、PRRSV混合感染进行早期快速诊断。

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