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《中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集》2004年
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我国弓形虫基因型的初步研究

谢德华  翁亚彪  李华文  郑唤钦  林瑞庆  张德林  朱兴全  
【摘要】:在不同动物体内的弓形虫可能具有不同的生物学特征,研究弓形虫分子遗传学及分子流行病学对弓形虫病的防制具有重要意义.随着寄生虫分子遗传学的发展,现已从研究弓形虫的表型发展到研究其基因型。运用聚合酶链反应连接限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析等方法从基因水平上研究弓形虫的分类、分布以及毒力等特征,已初步形成了将弓形虫虫株分为多个基因型的观点,但这方面的研究国内尚十分欠缺。本实验通过对国内来源于不同宿主的ZS 人株、SH 人株、CN 猪株、QH 绵羊株4个弓形虫虫株,以及国际标准强毒株RH 株的致密颗粒抗原(GRA6)基因进行PCR-RFLP 分析,首次对我国弓形虫虫株进行了基因分型研究,旨在对我国弓形虫基因型的分布情况有个初步的了解,从而为进一步的分子遗传学研究以及弓形虫病的防制提供资料.1 材料和方法1.1 虫株及DNA 样品国际标准强毒株RH 速殖子:本教研室传代保种:QH 绵羊株干虫粉:采自青海,由中国农业科学院兰州兽医研究所保存;ZS 人株、SH 人株,CN 猪株DNA:分别采自广州、上海和湖南省常宁,由中山大学基础医学院寄生虫教研室保存。1.2 PCR扩增及RFLP 分析使用Fazaeli 等(2000)发表的GRA6基因特异引物进行PCR 扩增,PCR 产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳,用DNA 胶回收试剂盒切胶回收PCR 产物。用Mse Ⅰ限制性内切酶对PCR 产物进行酶切,酶切产物用1.6%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像。1.3 测序及序列分析5株弓形虫的PCR 产物进行克隆后,送菌液到测序公司测序,测序结果用DNAstar 软件进行分析,寻找酶切位点,并与GenBank~(TM)注册的弓形虫强毒株RH 株以及弱毒株BEVERLEY 株和ME49株的GRA6基因序列进行比较分析。2 结果与讨论PCR-RFLP 分析显示两种带型:RH、SH、CN 3株弓形虫为一种带型,QH 和ZS 2株弓形虫为另一种电泳带型。GRA6序列分析结果显示:RH、SH、CN 3株弓形虫的GRA6基因序列上的Mse Ⅰ酶切位点与国外报道的RH 株一致,同属于基因型Ⅰ,为强毒株;QH 和ZS 2株弓形虫的Mse Ⅰ酶切位点与国外报道的弱毒株BEVERLEY 株和ME49株一致,同属于基因型Ⅱ,与PCR-RFLP 分析结果一致.除Mse Ⅰ酶切位点外,我国的几个虫株GRA6序列与GenBank~(TM)注册的RH 株及BEVERLEY 和ME49两株弱毒株有个别碱基的差异。结果初步证明我国人源弓形虫包含了Ⅰ、Ⅱ两种基因型,而动物源性弓形虫则因宿主和来源地不同亦有Ⅰ、Ⅱ两个基因型.

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