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《中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集》2003年
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禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株VPO、VP3、VP1蛋白基因的克隆、表达与活性检测

张二芹  赵振华  孙明  赵心力  陈西钊  王金玲  
【摘要】:本研究用冻存的禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株通过SPF鸡胚传代复壮,获得了实验用病毒样。根据已知AEV-1143株VpO、Vp1、Vp3基因序列,首先设计三对引物。通过RT-PCR分别扩增AEV-VRVpO、Vp1、Vp3基因,将扩增的VpO、Vp1、Vp3基因分别克隆到pGEM-T Easy载体中。经测序后,与已知1143株同源性:VpO为95.1%、VP1为93.9%、VP3为93.6%。然后设计表达引物,将扩增VpO、Vp1、Vp3再克隆到pGEM-T Easy载体中,此次设计引物分别在Vpo、Vp1基因5′端加入Bgl Ⅱ、NdeⅠ酶切位点和ATG,3′端分别加上XhoⅠ酶切位点和TTA。Vp3基因5′端加入BamHⅠ、NdeⅠ酶切位点和ATG,3′端加上SalⅠ酶切位点和TTA。然后再用BglⅡ、XhoⅠ对克隆的VpO、Vp1基因质粒酶切,BamH Ⅰ、SalⅠ对克隆的Vp3基因进行酶切,回收VpO、Vp1、Vp3基因片段插入到pGEX-4T-1表达载体内,对重组表达质粒进行酶切和PCR鉴定。挑取阳性ER2566表达菌用IPIG进行诱导表达蛋白,蛋白经电泳、纯化,然后用ELISA方法检测蛋白活性,Vp1蛋白活性相对高于VpO、Vp3。最后,再将自制VP1板用自配试剂检测其活性,同时用自制板和国外试剂、国外ELISA试剂盒、琼脂扩散试验检测同样10份血清作比较,三组ELISA检测结果,其中有8份被检血清S/P(抗体水平)大于0.2,为阳性;2份被检血清为阴性。这一结果与琼脂扩散试验检测结果一致。说明表达VP1蛋白活性达到预期要求,可以用作AE的ELISA诊断。

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