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鸡输卵管囊肿衣原体MOMP基因的克隆、序列测定及核酸探针的制备

李肇增  王金福  哈斯·阿古拉  闫红霞  关平原  申之义  李凤华  
【摘要】:以内蒙古地区鸡输卵管囊肿病病鸡中分离出的衣原体为材料.接种于80枚5-7日龄SPF鸡胚卵黄囊内.并分别感染L929、Vero、BHK21。细胞,增殖,提纯衣原体,提取DNA。依据国外禽衣原体MOMP基因的保守序列设计并合成了一对引物上游引物(P1):5‘GCTGGATTCCATGAAAAAATCTTGAAATCGGCAT3’.下游引物(P2):5‘CGACTGCAGTTAGAATCTGAATTGAG"CATTCAT 3’。以所提取到的衣原体DNA为模板经PCR扩增.并克隆于质粒PUCM-T后.重组子转化于大肠杆菌DH5a中.PCR扩增产物经PEA及电脉分析证明.所获得的目的基因成功克隆于载体之中.该片段为1.17kb的MOMP基因。采用随机引物标记法.用地高辛标记了MOMP基因核酸探针.用斑点杂交法检测衣原体MOMP DNA的灵敏度可达10pg。检测鸡新城疫病毒,传染性支气管炎病毒.大肠杆菌、沙门氏菌.巴氏杆菌等核酸均不敏感。与补体结合反应法对比.证明该探针具有较高的敏感性与较好的特异性。用SPF鸡胚接种衣原体.传6代.4-10天死亡的鸡胚较少且无规律。三种细胞系感染衣原体。传3代.其易感性依次为L929VeroBHK21。该核酸探针将用于疾病的诊断及病理学研究。

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