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分子克隆化鸡贫血病毒的重建研究

刘岳龙  崔治中  秦爱建  金文杰  
【摘要】:在前期研究中.本实验室已获得CAV病毒全基因组的体外克隆.但在病毒非编码区(也是病毒复制和转译调控区)存在不完整的EcoR I识别序列(5’-GACTTC-3’),因而不能自身环化重组子(pCAV2.4)。在此基础上,本研究通过PCR定向点突变法.将pcAV2.4的病毒非编码区的不完整的EcoR I序列(5’-CACTTC-3’)突变为完整的EcoR I识别序列(5’-GAATTC-3’).从而有利于CAV基因组的体外环化。将此重组子命名为pcAVE+。将pCAVE+大量扩增.用EcoR I切出CAV基因组2.3kb片段,在体外自身连接。用绿色荧光素报告基因(pEGFP质粒)对MSB1细胞进行转染预,确定最佳的转染DNA用量为1.0μg、最佳的转染细胞用量为1×106个/ml。将连接产物在转染剂Effectene的作用下转染CAV的宿主细胞(MSB1),经过7-8代的连续传代,获得了明显的具复制活性的CAV病毒。将此病毒经肌肉途径感染1日龄SPF易感雏鸡.在14-18天能出现典型的病变。但含有单拷贝CAV基因组的环型质粒pCAVE+直接转染MSB1细胞.不能转变出病毒。将pCAVE+中的病毒基因组(2.3kb)插入pCAV2.4的单-EcoR I位点.构建了含有双拷贝CAV全基因组同方向串联的重组子(命名为pCAV2E+.7,3kb)。将此pcAV2E+环型质粒大量扩增并直接转染MSB1细胞,同样获得了可复制性的病毒。本研究在病毒的非编码区特定点进行点突变,构建了含有单拷贝CAV全基因组和双拷贝全基因组同串联的重组子,并在MSB细胞成功转染为具复制活性的完整病毒。本研究思路和实验方法为将来在基因组水平体外构建低或无致病性的CAV活病毒的研究打下了基础。

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