用鼠抗鸡贫血病毒VP1的多抗血清检测病毒感染的间接免疫荧光法的建立和应用

【摘要】：鸡贫血病毒(CAV)的感染已广泛存在,它主要引起感染雏鸡的直接死亡和感染成鸡强烈的免疫抑制。CAV及早诊断是控制该痛的首要工作。CAV编码三个蛋白,即VPl(衣壳蛋白)、VP2、和VP3(细胞凋亡素,apoptin),VPl是CAV主要结构蛋白(50KDa)。在前期研究中,本研究组在大肠杆茵内以融合蛋白的形式,表达了CAV的VPl的95％编码区、完整的VP2和细胞凋亡素(Apoptin或VP3),尤其VPl的高效表达(融合蛋白占宿主细菌总蛋白的25.2％),并用VPl融合蛋白强化免疫小鼠制备了抗CAV VPl蛋白的多克隆抗血清。在此基础上,本实验利用鼠源抗VPl多抗血清对CAV感染细胞建立了间接免疫荧光检测法(IFA),并以所建立的方法对CAV田间病料进行了临床检测应用。(1)间接免疫荧光(IFA)检测:由于MSBl细胞是悬浮培养细胞,因此用悬浮细胞法做IFA试验,步骤如下:将CAV CUX—l病毒感染36—48hr的MSBl细胞低速离心弃上清;加PBS悬浮后再离心,细胞沉淀重悬浮于适量PBS中,分装50弘l(约1×10‘个细胞)/每个指型管;每管加入50pl 1:100稀释的鼠源多抗血清(为第一抗体),37℃水浴30min;以上述离心法洗涤后重悬浮;向每管中加入50/Jl商品化FITC标记的羊抗鼠IgG的抗体(1 t 2000稀释,为第二抗体),置37。C水浴30min;再用PBS离心法洗涤,重悬浮于50ptlPBS液中;滴加细胞于洁净的玻片上,以盖玻片轻轻覆盖,在倒置荧光显微镜下观察结果并摄像。检测结果中病毒感染细胞为绿色荧光阳性,而同步所做的小鼠阴性血清对CAV感染的MSBl细胞的反应组则为阴性。(2)IFA在临床检测中的应用:以抗VPl的鼠源多抗血清和上述所建立的悬浮细胞IFA方法对来源于江苏扬州(YZ9903)、海安(HA9805)、山东济宁(JN0007)、吉林(JI。0010)、云南昆明(KM9801)的CAV临床病料作实验室诊断,具体如下:将田间病料(鸡肝)用PBS(1:5,v/v)匀浆化并无茵化处理后,以1:10(v/v)的比例接种MsBl细胞培养液,48hr后取感染细胞进行IFA检测。同步提取感染细胞总DNA作为模板做CAV病毒核酸VP3基因(O.35kb片段)PCR检测。(以1日龄SPF鸡组织匀浆物感染的MSBl细胞为PCR阴性对照。)5个CAV田间病料在MSBl细胞的感染物,用上述抗VPl多抗血清和所建立的悬浮细胞IFA方法检测,结果为绿色荧光阳性,再对VP3基因O.35kb片段做PCR重复验证,也都为阳性,而SPF鸡对照组则为阴性。