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《第四届中国植物细菌病害学术研讨会论文集》 2008年
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水稻黄单胞菌全基因组小RNA的鉴定及其功能研究

贾燕涛  
【摘要】:水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)是造成水稻白叶枯病的致病细菌,白叶枯病是水稻生产中最严重的细菌性病害。给水稻生产带来重大损失。白叶枯病是一种维管束病害,自然条件下,病菌通常由水孔或伤口侵入,沿叶脉产生灰白色病斑。田间常在分蘖期观察到病症,并随植株的生长而发展,至抽穗期达到高峰。水稻遭受白叶枯病后,一般减产20-30%,严重时甚至绝收。非编码小RNA广泛存在于植物、动物及微生物中,但其作用机制有所不同。真核生物中21-28核苷酸(nt)长的小RNA(包括siRNA和miRNA)具有特异性降解外来遗传因子的防卫功能和调控内源基因表达的生理功能。近年来发现原核生物中存在长为20-500 nt的小RNA,它们参与转录和翻译水平的调节,涉及多种生理过程,如低温诱导特定小RNA表达,并调节相应基因的表达水平;某些植物病原菌的致病基因的表达也有小RNA的参与。这就使人们认识到原核生物的小RNA对基因表达调控有重要作用,原核生物小RNA的作用机制正在发展成为一个全新的分子遗传学研究领域。随着多种细菌全基因组序列的完成,使得大规模预测和筛选基因组中的小RNA成为可能,同时根据全基因组序列设计高密度的寡核苷酸芯片,研究在特定条件下小RNA及其调控的基因的表达,有利于对小RNA的功能进行阐述。对于植物病原菌来说,研究与逆境和致病性相关的小RNA的作用,有利于阐明小RNA在相关生理过程中作用机制,为防治植物病害提供新的途径。我们采用生物信息预测、建立cDNA文库及与基因芯片杂交等综合方法分析存在于Xoo中的小RNA。(Ⅰ)Xoo 10331菌株基因组序列与已公布的Xoo 10331菌株进行比较,发现两菌株的序列有99%的同源性,本研究中对Xoo 10331菌株序列信息进行了小RNA的生物信息学预测,发现小RNA候选基因108个,在Xanthomonas属保守的23个;(Ⅱ)构建了Xoo(OD600=1.5)的cDNA文库,随机挑取192个克隆并测序,rRNA和tRNA占37%,mRNA及mRNA和基因间隔区的克隆占45%,基因间隔区的克隆占13%;根据上述192条序列中rRNA和tRNA出现的丰度设计了15条探针,同时对10560个克隆进行了PCR扩增及产物纯化,得到9222个纯化的PCR产物,将这些纯化产物点膜,用15条探针与其进行了杂交,筛选得到3568个无杂交信号的克隆,并对其进行了测序,目前序列分析初步分析发现15个生物信息学预测的小RNA存在于cDNA文库中;(Ⅲ)为进一步研究小RNA在不同生理条件下,尤其是在和水稻相互作用过程中小RNA的功能,根据Xoo 10331菌株全基因组序列设计了基因芯片,并检测了XooΔhfq(小RNA结合蛋白)突变体和野生型的基因表达谱差异;对预测的小RNA可能作用的目的基因靶标进行了分析,结果表明hfq突变可能导致某些与致病相关基因的表达量的变化。从预测结果中挑选了11个候选小RNA进行了RT-PCR、Northern及5'RACE和3'RACE分析,以实验验证预测的小RNA的表达情况。到目前为止发现的小RNA多是在胁迫情况下及超表达时行使调节功能,因此对上述部分候选小RNA构建了超表达载体和缺失突变体,以研究Xoo的小RNA表达与其对植物宿主水稻的致病性的关系。

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