CMV卫星RNA人工突变体在烟草上复制和积累的研究

【摘要】：卫星 RNA(satellite RNA,satRNA)是一类伴随植物病毒侵染、依赖于后者进行复制、包被和运输的亚病毒小 RNA 分子。我们筛选获得一株能够伴随辅助病毒 CMV-Fny 复制,但其5′端比大部分 CMV-satRNA 缺少2个碱基的卫星 RNA(2msat)。本研究通过 PCR 技术在其5′端 (5′-GUUGUUUG……-3′)进行“碱基加/减”,获得了一系列人工构建的2m 衍生突变体： 2mF1((2m-U,5′-GUGUUUG……-3′)、2mF2(2m-UU,5′-GGUUUG……-3′)、2mF3(2m-UUG, 5′-GUUUG……-3′)、2mF4(2m+U,5′-GUUUGUUUG……-3′)、2mF5(2m+UU,5′-GUUUUGUUUG……-3′)、 2mF6(2m-GUUG,5′-UUUG……-3′)和2mF7(2m-GUUGU,5′-UUG……-3′)。2msat 及其突变体的体外转录产物分别与 CMV-Fny 病毒 RNA 混合接种普通烟(Mcotiana tabaccum),进行假重组分析。接种3d,RT-PCR 检测接种叶上 satRNA 复制的结果表明：2msat 的5′端缺失1～3个碱基,或者在5′端的第一个 G 后面添加 U 或 UU,其相应突变体均可依赖 CMV-Fny 在烟草中进行复制；而一旦5′端的4个碱基(GUUG)被缺失,2msat 则不能复制。因此,2msat 的5′端至少必须具有 GUUU 元件,才能在烟草中进行复制。接种7d、14d 和21d,RT-PCR 检测 satRNA 在系统叶中复制的结果显示：接种7d,2msat 及其突变体均存在于寄主组织中；接种14d,系统叶中检测到2mF3sat、2mF4sat 和2mF5sat,而不能检测到2mF1sat 和2mF2sat；接种21d,系统叶中只能检测到2mF4sat 和2mF5sat。不同接种时间,用 Real-time RT-PCR 分析接种叶和系统叶组织中卫星 RNA 的相对含量,结果如下,接种3d,2msat、2mF1sat、2mF2sat、2mF3sat、2mF4sat 和 2mF5sat 在接种叶相对含量之比为1：1．05：1．93：1．59：1．98：1．57；接种5d,其相对含量依次为1：0．91：1．26：0．85：1．17：1．08,以上结果说明在接种叶中卫星 RNA5′端结构改变对2msat 的积累量影响没有明显的差异。在系统叶中,2msat 及其突变体的含量为2mF4sat＞2mF5sat＞ 2mF3sat＞2msat＞2mF1sat＞2mF2sat,并且在3个检测时间,2mF4sat 的含量均远高于其它突变体。上述结果表明：5′端结构不仅直接与 CMV 卫星 RNA 复制相关,还可能影响卫星 RNA 在寄主中的积累量。