限制性内切酶和农杆菌介导的串珠镰刀菌插入突变与致病性突变体的分离

【摘要】：利用限制性内切酶介导的整合(REMI)和农杆菌介导的转化技术(ATMT)转化串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)FT1菌株,以研究其致病的分子机制。以含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒 pUCATPH 转化串珠镰孢菌 FT1原生质体,共获得转化子300多个。原生质体制备采用 PDB 培养14小时的菌丝,以0．7mol／LNaCl 为稳渗剂,在30℃、100rpm 下用20mg/ml 溶壁酶酶解4 小时为最佳。将 pUCATPH 上的潮霉素磷酸转移酶基因切下,连入质粒 pROKⅡ,构建得到真菌转化载体 pROKⅡ-HPH,冻融法转化农杆菌 LBA4404,建立起了农杆菌介导转化串珠镰孢菌(F． verticiUieides)获得 T-DNA 插入突变体的体系。优化了转化条件,在镰孢菌孢子浓度10~6个/mL、农杆菌 OD_(600)=0．15～0．20、乙酰丁香酮浓度为200μmol/mL 的条件下共培养36h 转化率最高,可达 60～120个/10~6个孢子,共获得转化子1000多个。获得的转化子转接5代能稳定遗传,PCR 验证潮霉素基因已插入转化子基因组 DNA 中。通过表型观察和致病性测定发现部分转化子表现为生长和形态异常,并有两株致病性明显减弱的突变体,目前正在通过 TAIL-PCR 和反向 PCR 扩增突变基因。该转化体系的建立为研究该菌的致病机制和功能基因分析奠定了基础。