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《绿色生态可持续发展与植物保护——中国植物保护学会第十二次全国会员代表大会暨学术年会论文集》2017年
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苦豆子内生真菌NDZKDF_(13)诱导子对宿主赖氨酸脱羧酶基因表达的影响

孙牧笛  胡丽杰  顾沛雯  
【摘要】:目前,通过添加真菌诱导子刺激植物组织来提高次生代谢物产量的研究已经成为国内外研究的热点,内生真菌普遍存在于健康植物组织中,是植物微生态系统的重要组成部分。与植物在长期"协同进化"过程中形成了一种稳定的互惠共生关系,大量研究表明,内生真菌可能产生与宿主相同或相似的次生代谢产物。本研究利用荧光定量PCR技术检测由苦豆子内生真菌NDZKDF_(13)诱导后宿主赖氨酸脱羧酶基因的表达情况。从分子角度研究苦豆子内生真菌诱导子对宿主合成喹诺里西啶碱生物碱途径关键酶活性的影响,探讨苦豆子合成生物碱的诱导途径和诱导机制。赖氨酸脱羧酶(Lysine Decarboxylase,LDC)基因是苦豆子(Sophora alopecuroides L.)苦参碱(Matrine,MT)和氧化苦参碱(Oxymateine,OMT)生物合成途径的第一个关键酶基因,在其生化代谢过程中起着重要的作用。针对LDC基因设计了一对特异性引物QLDC,同时设计1对扩增内参基因Lectin引物,提取苦豆子各不同处理样本总RNA并反转录得到cDNA,以混合样本cDNA为模板,5倍梯度稀释作为标准样品,用于实时荧光定量PCR中QLDC基因及内参基因Lectin标准曲线的构建,并对实时荧光定量PCR反应的反应条件及熔解曲线、灵敏度等进行了初步探索。利用优化后的实时荧光定量PCR反应体系,检测苦豆子内生真菌NDZKDF_(13)诱导处理下与不接入诱导子处理下,在不同诱导时间里,组培苗中LDC基因的相对表达积累情况。结果表明:采用以QLDC-F/R为目的基因,以Lectin-F/R为内参基因的相对定量检测苦豆子中赖氨酸脱羧酶基因表达的方法。其标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,目的基因与内参基因的扩增效率都为99%,相关性系数分别为0.995 09和0.998 25,目的基因与内参基因的灵敏度分别是半定量RT-PCR的5~2倍和5倍,在稀释度为5~(-7)倍时达到灵敏度检测下限,且其熔解曲线分析结果显示产物特异的单峰。苦豆子无菌组培苗经过内生真菌NDZKDF_(13)诱导后LDC基因表达显著上调,与对照组的LDC基因的表达趋势相似,皆随时间增长呈现先上升后下降再上升的趋势,内生真菌NDZKDF_(13)诱导组在各个时间点的LDC基因表达量都高于对照组,在诱导第9天时达到峰值,基因相对表达量达到对照的580.15倍。苦豆子内生真菌诱导子NDZKDF_(13)在一定程度上促进宿主赖氨酸脱羧酶基因的表达。

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