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《植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集》2011年
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稻纵卷叶螟气味结合蛋白基因的克隆与原核表达

刘苏  周文武  程家安  祝增荣  
【摘要】:昆虫的生存和繁衍依靠其敏锐的嗅觉。在昆虫的嗅觉过程中,小分子气味物质进入触角感器上的孔道,与载体蛋白相结合,穿过淋巴液作用于气味受体,最终使感觉神经元产生神经冲动。这类载体蛋白分为气味结合蛋白(odorant-binding protein,OBP)和化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)两大类,其中OBP又分为普通气味结合蛋白(general odorant-binding protein,GOBP)和信息素结合蛋白(pheromone-binding protein,PBP)两个亚家族,在昆虫感受普通气味物质和性信息素的过程中起作用。稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)是一种重要的水稻害虫,每年对水稻生产都造成巨大损失。农药的滥用,不仅使该虫产生抗性,杀伤天敌,而且污染环境,为害人体健康。GOBP和PBP在昆虫识别寄主植物、交配及选择产卵场所等行为过程中具有重要作用,对该类蛋白进行研究,可以为研发无污染、不杀伤天敌、对环境友好的高效引诱剂提供理论依据,为稻纵卷叶螟的防治提供新的途径。我们通过搜索Genbank上登录的鳞翅目昆虫GOBP和PBP基因序列,根据保守区设计简并引物,采用RT-PCR方法并结合RACE技术获得了稻纵卷叶螟2个普通气味结合蛋白(CmedGOBP1、CmedGOBP2)和1个信息素结合蛋白(CmedPBP)基因的全长序列。序列分析表明,这3个蛋白的氨基酸序列中均具有6个保守的半胱氨酸残基,且符合"C_1-X_(25-30)-C_2-X_3-C_3-X_(36-42)-C_4-X_(8-14)-C_5-X_8-C_6"规则;去除信号肽后,成熟的CmedGOBP1、CmedGOBP2和CmedPBP分别编码144个、139个和142个氨基酸残基,理论分子量分别为16.69kDa、16.09kDa和15.85kDa,等电点分别为5.0、4.89、5.28,表明这3个蛋白均为小分子量的酸性蛋白,具有气味结合蛋白的典型特征。用MEGA软件构建了CmedGOBP1、CmedGOBP2和CmedPBP与其他鳞翅目昆虫同源基因的进化树,结果显示,稻纵卷叶螟与同为螟蛾科的二化螟(Chilo suppressalis)、草地螟(Loxostege sticticalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和亚洲玉米螟(O.furnacalis)聚为一个分支。我们根据得到的基因序列,在编码成熟蛋白的5'端和3'端分别设计引物(分别加入KpnI和XhoI酶切位点),双酶切后连入pET32a,构建了重组表达载体,转化大肠杆菌OrigamiB(DE3)细胞进行表达。SDS-PAGE表明,3种蛋白均在细胞裂解液的上清中呈可溶表达。CmedGOBP1、CmedGOBP2和CmedPBP在大肠杆菌中的高效可溶表达为下一步的结构及功能研究打下了基础。本研究不仅补充了鳞翅目昆虫GOBP和PBP家族新成员,也为利用昆虫的嗅觉进行害虫防治提供了新的思路。

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