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《植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集》2011年
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HC-Pro三个参与抑制RNA沉默氨基酸位点的鉴定

王洁  刘金亮  阴筱  高瑞  李向东  刘焕庭  
【摘要】:马铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是第一个被鉴定的RNA沉默抑制因子。HC-Pro抑制RNA沉默的能力往往和病毒的致病力、协生能力相关。为了明确HC-Pro结构对抑制RNA沉默功能的影响,我们对马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)HC-Pro进行定点突变,获得了3个突变体,分别是F_6Del、N_(11)Del和DEN,其中,Phe6在大多数马铃薯Y病毒属病毒中是保守的位点,Asn~(11)是推定的糖基化位点,而IGN基序则可能与病毒及因素复制有关。将野生型HC-Pro.pAGUS和3个突变体转化农杆菌后分别与pAGFP和pAhpGFP农杆菌共浸润本氏烟叶片。以野生型pAHC_(wt)和pAGUS共浸润后的植株分别作为阳性对照和阴性对照,分析了突变对HC-Pro抑制RNA沉默活性的影响。分别在共浸润后的第四天和第六天对浸润区域的GFP的表达量进行了观察,结果显示,第四天F_6Del和N_(11)Del的浸润的叶片区域荧光强度明显低于pAHC_(wt),DEN与pAGUS浸润区域都不表现明显的荧光,第六天的观察结果与第四天的相比,F_6Del和N_(11)Del的荧光强度明显下降,而pAHC_(wt)基本不变。利用Northern blotting和Western blotting的方法检测了叶片共浸润区域GFP在核酸和蛋白水平上的表达情况。Western blotting的结果与荧光观察结果一致。Northern blotting结果表明,F_6Del和N_(11)Del的GFP mRNA表达量明显低于pAHC_(wt).DEN注射的叶片中没有GFPmRNA的积累。而在所有突变体重均能检测到GFP siRNA的积累,其中,在pAHC_(wt)共浸润的叶片中GFP siRNA积累量最少,用含pAHC-N_(11)Del和pAHC-F_6Del农杆菌共浸润的叶片中GFP siRNA积累量相对较多,而在用含pAGUS和pAHC-DEN农杆菌浸润的本氏烟叶片中GFP siRNA量最多。荧光的强弱与绿色荧光蛋白的表达量和GFP mRNA的量呈正相关,而与GFP siRNA的积累量呈负相关。这些结果表明,Phe~6、Asn~(11)的缺失降低了PVA HC-Pro抑制RNA沉默活性,IGN基序中的Ile~(250)和Gly~(251)分别突变为Asp和Glu使HC-Pro完全丧失了抑制RNA沉默活性。即IGN对于PVA HC-Pro抑制RNA沉默是必需的,HC-Pro调控基因组复制和抑制RNA沉默的功能域部分重合;保守氨基酸Phe~6和糖基化位点Asn~(11)对于抑制RNA沉默活性不是必需的,但可以调控PVA HC-Pro抑制RNA沉默活性的强弱。

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