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食线虫真菌碱性蛋白酶cDNA基因的克隆及在Pichia pastoris中的异源表达

赵明莲  张克勤  
【摘要】:从一种食线虫真菌——粉红粘帚霉(Gliocladium roseum,重寄生真菌)的液体发酵液中纯化到一种有显著固定线虫作用、降解线虫体壁的蛋白酶,其分子量约为33KDa,等电点约为pH10.5,最适反应温度为55~60℃,最适pH为12.0,酶活性不受EDTA的影响,却能被PMSF完全抑制,能被胶原蛋白酶抑制剂Ⅱ部分抑制,表明该蛋白酶是具有溶胶原活性的丝氨酸类蛋白酶,属于碱性蛋白酶。电印迹转膜,测定蛋白酶的氨基末端序列,推导设计兼并引物,应用3’RACE技术克隆获得编码该碱性蛋白酶成熟肽的cDNA 基因,并在编码基因的5’和3’末端引入限制性酶切位点。用相应的限制性内切酶将酵母表达载体在多克隆区切开,用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理后,将碱性蛋白酶编码基因克隆到分泌型表达载体的多克隆区,酶切分析和测序鉴定以确保读码框的正确。将Sac Ⅰ线性化的重组载体用电击转化法导入酵母宿主菌中(Pichia pastoris),在抗性筛选平板上挑取50个目标转化子克隆进行小量表达实验,将有酶活的培养液进行western blotting以鉴定表达的重组碱性蛋白酶,结果显示成功实现了食线虫真菌碱性蛋白酶cDNA基因的异源系统表达。

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