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《第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集》2006年
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树突状细胞-肝癌细胞株HepG2融合细胞来源的Exosome制备及抗其肝癌免疫活性的实验研究

张红梅  张利旺  刘文超  任军  
【摘要】:目的:以树突状细胞(DC)为基础的肿瘤免疫治疗虽在基础研究及临床试验中初见成效,但其应用中尚存在一些问题:①DC体外培养繁琐、扩增有限;②细胞性瘤苗制备复杂、技术要求高、难以质控;③长期保存困难,临床大量应用受限。目前发现肿瘤细胞和DC均能分泌一种膜性微囊结构exosome,其重要特性是表达来源细胞的各种功能蛋白,因此具有重要的免疫学功能。为避免DC临床应用中的不足,本研究以原发性肝癌为例,尝试以树突状细胞和肝癌细胞的融合细胞为来源制备exosome,目的在于制备出一种比传统单纯源于DC或单纯源于肿瘤细胞的exosome更具有免疫治疗效果的新型 exosome瘤苗,进而探讨其生物学特性、免疫学功能及抗肿瘤免疫活性,以期该瘤苗既有肝癌细胞的抗原性又具备DC活化T 细胞的功能,可直接激活T细胞,诱发针对肿瘤的特异性免疫应答;为研制具有临床应用前景的高效非细胞性肿瘤疫苗提供新的思路。方法:以血细胞分离机分离富集HLA-A2+肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC),利用GM-CSF、IL-4体外定向诱导DC,诱导第五日加入促成熟因子TNF-α,获取成熟DC;以PEG诱导DC和HepG2细胞融合;以免疫磁珠分选DC- HepG2融合细胞,以纯化的细胞上清为来源,通过超滤(Centrip lus离心超滤管,100k)及超高速密度梯度离心法(含30%蔗糖的重水,80,000g,2h)制备exosome;滴网法以透射电镜观察exosome形态,流式细胞术、ELISA等方法检测exosome蛋白分子表达;以exosome直接刺激效应T细胞,MTT法检测效应T细胞对靶细胞HepG2的杀伤活性;ELISA法检测该效应T细胞分泌 IFN-γ水平。结果:肝癌患者外周血单个核细胞经体外诱导培养,可获得具有典型形态及功能的DC;以DC-HepG2融合细胞培养上清为来源,可制备获得exosome小体,于透射电镜下观察,此exosome为直径50-100nm的膜性微囊,圆形或椭圆形,有完整包膜;FCM检测结果表明,exosome含有DC的特征分子CD86(94.6%)和肝癌细胞HepG2的AFP抗原(40.7%);经 ELISA检测,证实exosome提取物中含有AFP蛋白(255.78±22.38ng/ml);DC-HepG2来源的exosome活化的T细胞(Exo- L),对靶细胞的杀伤率分别为:HepG2(58.58±6.07)%、SMMC-7721(17.63±1.45)%、K562(12.83±2.71)%,而单纯淋巴细胞(L)对HepG2、SMMC-7721、K562细胞的杀伤率分别为(12.00+2.72)%、(11.43±2.65)%和(11.63±3.14)%;Exo-L组对HepG2的杀伤率显著高于对其他两种靶细胞的杀伤率(P0.05),也明显高于单纯L组对HepG2细胞的杀伤率(P0.05)。靶细胞为HepG2时,Exo-L组IFN-γ分泌量明显高于单纯L组(286.88±52.00pg/mL vs 39.48±9.78pg/mL,P0.05)。结论:以肝癌患者树突状细胞与肝癌细胞HepG2之融合细胞为来源,经超滤和密度梯度离心法,可制备获得直径为50-100nm 的exosome瘤苗,该瘤苗同时含有DC相关分子及HepG2相关蛋白,无须DC存在,可直接激活自体T淋巴细胞,产生HepG2 抗原特异CTL,显示了比传统制备的exosome更强的功能,在非细胞性疫苗生物治疗方面前景广阔。

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【共引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【相似文献】
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7 赵彦;脑胶质瘤周边组织树突状细胞浸润与肿瘤生物学特性的相关研究[D];青岛大学;2006年
8 吕牮;树突状细胞肿瘤疫苗抗肝癌作用的实验研究[D];吉林大学;2005年
9 邵斯亮;前列腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞诱导特异抗瘤作用研究[D];山东大学;2006年
10 国建飞;食管癌引流淋巴结细胞的培养及体内抑瘤试验[D];河北医科大学;2006年
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