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《第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集》 2006年
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Tiam1基因表达沉默后对结直肠癌细胞蛋白表达谱的影响

刘莉  丁彦青  
【摘要】:目的:新近的研究发现,T淋巴瘤侵袭作用基因1(T lymphoma invasion and metastasis 1,Tiam1)参与结直肠癌的增殖、转移,但确切的作用机制还不清楚。本研究的目的在于探讨Tiam1介导结直肠癌增殖、转移的分子机制。方法:设计Tiam1 干扰片段,构建含U6启动子的慢病毒载体,将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT病毒包装细胞,收集病毒上清,进行病毒滴度测定,用慢病毒感染结直肠癌细胞,用RT-PCR和Westernblot鉴定有效的干扰载体。用含Tiam1特异性干扰片段的慢病毒感染SW480/EGFP+细胞,用含空载体的病毒做对照。用杀稻瘟菌素筛选抗性克隆,挑取抗性单克隆,荧光定量 PCR和Western blot鉴定干扰后Tiam1基因在细胞中的表达;利用蛋白质组学技术分离SW480/EGFP+/Tiam1-和SW480/ EGFP+/mock细胞的总蛋白,建立重复性和分辨率较好的细胞双向凝胶电泳图谱,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异表达的蛋白质点。利用软件过滤基线峰、识别信号峰,利用Matrixseience公司的在线软件Mascot Distiller进行搜索分析。利用荧光定量PCR、Western blot方法对所获得的差异蛋白质进行鉴定。结果:构建了四个干扰Tiam1基因表达的慢病毒干扰载体,将慢病毒质粒和辅助质粒共转染293FT病毒包装细胞,收获病毒上清,测定病毒滴度为7×105 Transducing Unit(TU)/ml。利用慢病毒感染SW480/EGFP+细胞,荧光定量PCR和Western blot结果发现含片段B的慢病毒干扰载体的干扰效率最高(73%)。利用含干扰片段B的慢病毒和空载体病毒感染SW480/EGFP+细胞,挑取杀稻瘟菌素抗性单克隆,荧光定量PCR和Western blot结果发现Tiam1在干扰克隆2中表达降低最明显(命名为SW480/EGFP+/Tiam1-),干扰效率达 88%。SW480/EGFP+/Tiam1-细胞为通过RNAi技术使Tiam1表达沉默的细胞,其表达的蛋白质与SW480/EGFP+/mock细胞相比,在数量和表达水平上亦发生了一定的变化,而这些发生改变的蛋白质亦与Tiam1的促进转移作用相关。因此,利用比较蛋白质组学的方法,分析这些细胞蛋白质表达的变化,可发现与Tiam1作用相关的蛋白质,从而了解其发挥作用的分子机制。在本研究中,利用蛋白质组学技术分离细胞的总蛋白,结合图像分析和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对部分差异表达的蛋白质点进行鉴定,共鉴定了20个差异表达的蛋白质点。我们对鉴定的蛋白质的功能进行分类,主要为与细胞代谢、细胞增殖、细胞骨架结构相关的蛋白,以及分子伴侣和未知功能的蛋白。这些差异蛋白质中有一些同肿瘤的增殖、转移密切相关。结论:Tiam1基因是结直肠癌增殖、侵袭、转移的促进基因,Tiam1可能参与多条信号通路来介导它在结直肠癌中的作用,在相互作用的蛋白中HMGB1、PGAM1和ANXA4与Tiam1关系密切,他们是Tiam1信号通路中的新蛋白。

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