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《第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集》2006年
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RNA干扰沉默HIF-1α对人乳腺癌细胞功能的影响

韩之波  王晗  任贺  赵辉  刘拥军  韩忠朝  
【摘要】:目的:研究靶向针对缺氧诱导因子-1 α(HIF-1 α)的短发夹RNA(shRNA)对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞功能的影响。方法:通过在细胞培养中加入150 μ mol/ L氯化钴(CoCl2)模拟低氧环境。采用RNA干扰技术,构建靶向针对HIF—1 α的shRNA真核表达载体,利用脂质体 lipofactamine 2000将shRNA真核表达载体转染入MCF- 7细胞中,经G418(400 μ g/ml)筛选得到抗性克隆。MCF- 7细胞经150μmol/L的CoCl2处理24小时后,通过Real— time PCR和Western blot分别检测HIF-1 α的mRNA和蛋白水平的变化。Annexin V/PI荧光标记检测细胞经150 μ mol/L的CoCl2处理24小时后MCF-7细胞凋亡的变化。同样通过Real-time PCR和Western blot分别检测转染 shRNA后MCF-7细胞中HIF-1 αmRNA水平和蛋白水平的变化。30μg/ml阿糖胞苷(Ara-c)作为凋亡诱导剂, Annexin V/PI荧光标记和DNA ladder分别检测Ara-c作用48小时后,同时加入150μmol/L的CoCl2,干扰组、对照组细胞凋亡的区别。用Sub-G1测定未加任何凋亡诱导剂,只加入150 μ mol/L的CoCl2后,干扰组、对照组细胞凋亡的区别。半定量RT—PCR检测RNA干扰HIF-1 α后,MCF-7中血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化。流式细胞仪检测RNA干扰HIF-1 α后,MCF-7细胞周期的变化。结果:相对于常氧环境,缺氧条件下,MCF-7细胞中的 HIF—1 α表达增加,而凋亡率降低。shRNA转染MCF-7细胞后,与对照干扰载体比较,干扰组MCF-7细胞HIF-1 α mRNA显著减低(p0.0001),HIF-1 α蛋白表达下调91. 63%(p0.01)。阿糖胞苷(Ara-c)作用48小时后,同时加入150 μ mol/L的CoCl2,干扰组细胞的凋亡率为(84.64 ±2.47)%,对照组为(34.97±8.96)%,干扰组较对照组增加62.15%(p0.01);同样的处理条件,DNA片段化的结果显示:干扰组表现出DNA ladder,对照组无DNA ladder。未施加凋亡诱导因素时,CoCl2处理24小时后,干扰组的凋亡率为(10.74±0.52)%,对照组为(0.14±0.03)%,干扰组较对照组增加98.42%(p0.01)。CoCl2处理24小时后, 通过半定量RT—PCR检测VEGF mRNA的表达,与对照组相比,干扰组中的VEGF mRNA下调66.8%(p0.05), 干扰组细胞周期进程也较对照组减缓。CoCl2处理24小时后, 通过流式检测G0/G1期对照组(40.34±0.73)%,干扰组为(69. 23±1.65)%,(p0.05)。结论:HIF-1 α在MCF-7细胞中发挥抗细胞凋亡的作用。我室构建的针对HIF-1 α的shRNA 能够促进MCF-7细胞凋亡,下调VEGF表达,推迟细胞周期,从而为将该RNA干扰片段应用干乳腺癌的治疗提供理论依据。

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