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新生大鼠嗅鞘细胞的体外培养及鉴定

余资江  余彦  杨丹  决利利  周静  
【摘要】:探讨新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及纯化方法。取新生3~5 d的Wistar大鼠,在无菌环境下摘除嗅球,置于少量ACSE中(4℃),于解剖显微镜下剥离其神经层、嗅神经及脑膜,用ACSF洗2次,将组织块剪碎;0.25%胰酶(添加DMSO和胶原酶Ⅳ),于37℃,10%CO_2孵育15 min,终止反应,离心1 200 r/min 5 min;移入含牛垂体提取物(BFE)的DMEM/F12(胎牛血清20%),调节细胞浓度为1×10~6~1.5×10~6/ml,接种子于培养瓶内。采用差速贴壁法去除未贴壁及贴壁不稳定的细胞,培养3 d后换液,在培养液中加入阿糖胞苷(Ara-C,终浓度10~(-6)mol/L),48 h后,用培养液洗3次。DMEM/F12培养,12 h后,再加含有Ara-C的培养液,24 h后,洗3次。用12μg/ml BPE刺激细胞生长。胰酶消化,收集细胞悬液,弃上清,用含20%FCS的DMEM/F12制成细胞悬液,接种在PLL和胶原双重处理过的盖玻片和培养瓶中,常规培养。用GFAP和NGFRp75免疫组织化学方法确认OECs并测定其纯度。结果表明,采用差速贴壁法结合Ara-C的方法可获得高纯度的原代嗅鞘细胞,其形态主要为双极、多极和无突起形,细胞突起细长并交织成网状,细胞纯度达90%以上,该方法步骤简便,可重复性好,为后续实验提供了基础。

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