“臂-爪”状loop的赖氨酸突变加速纤维二糖水解酶的催化循环

【摘要】：木质纤维素生物质转化后可生成生物燃料和生物化学品等,用于能源和化工等领域[1]。然而,在工业中,生物转化木质纤维素的成本仍然较高,而用酶成本是主要因素之一[2]。纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase I,CBHI)是复合酶中最重要的组成部分,加速其催化循环,增强其降解纤维素的能力对于木质纤维素生物转化成本的降低至关重要。为了寻找可行的策略以加速CBHI的催化循环,我们对该体系进行了大规模的分子动力学模拟,揭示了纤维二糖排出催化通道的"臂-爪"机制,即在产物结合位点附近的loop如同柔性臂一样接近纤维二糖,在该loop上的389位的苏氨酸如同"爪"子一样捕获该产物。为了增强这种捕获作用,我们设计了五组突变。其中,赖氨酸突变显著加速了纤维二糖的排出,并显示出具有深入催化通道拖拽后续糖链的作用,促进了糖链的向前运动。进一步,考察了该突变残基对催化循环的限速步骤??糖基化反应的影响。利用QM/MM方法计算了糖基化反应的关键步骤??质子转移过程的自由能变化曲线,结果表明该赖氨酸突变降低了质子转移过程的自由能能垒。最后,为了实验验证上述模拟结果,我们全基因合成了CBHI,并在毕赤酵母中重组表达后用于水解底物。酶促动力学的结果表明,该赖氨酸突变加速了酶的反应速度,这归功于质子转移能垒的降低。此外,赖氨酸突变后显著地增强了形成催化通道的部分loop的柔性,加速了酶从底物上的解离,从而提高了对微晶纤维素的降解能力。本工作丰富了人们对CBHI催化循环的认知,赖氨酸突变策略有望降低用酶成本,并将为增强纤维素酶催化效能的策略设计提供指导。