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《第十届全国化学生物学学术会议报告摘要集》2017年
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IspD蛋白克隆表达和及其抑制剂高通量活性筛选

周雅情  王俊丽  李伟国  涂海洋  张爱东  
【摘要】:IspD蛋白是植物和细菌2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)的关键酶,建立IspD蛋白克隆表达及其酶抑制剂的高通量筛选方法在发展新型除草剂和杀菌剂研究中具有重要意义。本文首先尝试从拟南芥中提取总RNA,逆转录合成cD NA,采用PCR扩增,获得全长IspD基因和IspD(76-303)活性域片段基因,连接至pColdⅠ载体,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)进行了高效表达。其中,全长基因IspD蛋白以包涵体形式表达,变性复性纯化,获得的可溶性全长基因IspD蛋白稳定性差;采用IspD(76-303)片段基因可以实现IspD活性域蛋白的可溶性表达,经过镍柱亲和层析纯化,可获得高表达、高纯度的IspD酶蛋白。以2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸作为底物,采用高相液相色谱法标定了IspD酶活性。利用钼酸铵和孔雀石绿混合溶液与酶反应产物磷酸的显色反应,以96孔板酶标仪检测为手段,建立了MEP途径IspD酶专属的抑制剂生物活性高通量筛选方法。采用该方法,对本实验室设计合成的先导化合物库进行筛选,获得了一部分高酶抑制活性的先导化合物,为研究新型IspD酶蛋白抑制剂奠定了基础。

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