无机砷及其代谢物对人成纤维细胞的毒性作用

【摘要】：目的体外培养人真皮成纤维细胞,用无机砷及其代谢物进行染毒,观察染毒后细胞增殖、周期及凋亡,并检测DNA修复相关的XPA,XPC,PARP1和ERCC3基因的表达变化,探讨砷及其代谢物导致细胞皮肤损伤的分子机制。方法取8例6～10岁健康儿童志愿者包皮组织进行原代培养、分离人真皮成纤维细胞。传代培养至第10代后,分别以无机砷化合物亚砷酸钠(Na_2AsO_2)、二甲基胂酸(DMA~V)、单甲基胂酸(MMA~Ⅲ)进行染毒,混匀分为4组,即高、中、低、对照组。在72 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,检测不同浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V和MMA~Ⅲ(0,5,10,15和25μmol·L~(-1))对人真皮成纤维细胞体外增殖的变化。流式细胞仪(Flow cytometer)检测不同浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V和MMA~Ⅲ(0,5,15和25μmoI.L~(-1))刺激人真皮成纤维细胞的凋亡和周期变化状况。通过实时荧光定量(PCR)检测不同浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V和MMA~Ⅲ(0,5,15和25μmol·L~(-1))刺激人真皮成纤维细胞后,修复基因XPA,XPC,PARP1和ERCC3的表达水平。结果人真皮成纤维细胞通过MTT比色法检测得出结果:和对照组对比,人真皮成纤维细胞经不同浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ刺激后,吸光度值发生变化,存在剂量-反应关系(P0.05);用0,5,15和25μmol·L~(-1)的iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ的浓度作用人真皮成纤维细胞,Go/G,期细胞比例明显下降(P0.05),G_1/M期和S期细胞比例较对照组明显增加(P0.05);高、中剂量iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ处理组细胞G_1期细胞所占百分数增多,提示细胞在G_1期出现阻滞的趋势,G_2和S期细胞所占百分数较少。XPA,XPC,PARP1,ERCC3在iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ药物作用下,mRNA在0～10μmol·L~(-1)浓度的表达量出现上升趋势,而随着iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ药物作用浓度的增加,在15～25μmoI·L~(-1)浓度的mRNA表达量显示有下降趋势,有统计学意义(P0.05)。结论在细胞增殖试验中,不同浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ诱导人真皮成纤维细胞后,吸光度产生了明显的变化,0～10μmol·L~(-1)浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ对人真皮成纤维细胞有促进细胞增殖作用,而15～25μmol·L~(-1)浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ对人真皮成纤维细胞有抑制细胞增殖作用。0～10μmol·L~(-1)浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ对人真皮成纤维细胞促进XPA,XPC,PARP1和ERCC3基因的表达,15～25μmol·L~(-1)浓度的iAs~Ⅲ,DMA~V,MMA~Ⅲ对人真皮成纤维细胞抑制XPA,XPC,PARP1和ERCC3基因的表达。