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《中国毒理学会第二届全国中青年学者科技论坛会议论文集》2007年
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组织特异性RNA干扰与小鼠肢芽体外培养联合技术的研究(摘要)

朱勇飞  朱江波  万旭英  朱玉平  张天宝  
【摘要】:目的:将 RNAi 技术和体外肢芽培养技术结合起来,以期建立一种研究发育相关基因功能的新方法,并初步研究 Hspb10在小鼠肢发育过程中的作用。方法:选取 Hspb10序列,设计并合成 siRNA,其序列为:正义链 GTA GGA AGA TGA TCT TAT A,反义链 TATAAG ATC ATC TTC CTA C;载体为 H1/Neo/GFP/NON RNAi 载体。取孕12天(GDl2)小鼠,分离出其48~52体节的胚胎,在解剖显微镜下,于 Hank's 平衡盐溶液中分离、收集胚胎的前肢,并用培养基洗涤两次。使用 CellTram 油压显微注射器进行显微注射,实验组每个肢芽注射100nl siRNA 溶液(含132ng siRNA),注射部位为肢芽近脊柱侧。在阴性对照组,每肢注射140.0ng H1/Neo/GFP/NON RNAi 载体(约 100n1)。然后,每个培养瓶约放入6ml 培养基、12~15个肢芽,用每隔24小时充气一次的浸没旋转式培养法(转速为30±5 rpm/min)在37.5±0.5℃的条件下培养。培养基为 75%BGJb 培养基、25%盐溶液(NaCl 7.0g/L,KCl 0.42g/L,CaCl_2 0.67g/L)、0.85mmol/L 维生素 C、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素;临用前配制,经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。混合气体由45%O_2、50%N_2和5%CO_2组成。于培养6、12、24、48、72小时后, 分别从实验和对照组中取出12个肢芽,用 PBS 冲洗,于荧光显微镜下观察其外形。将6 个肢芽用于阿利新蓝染色,观察骨骼发育情况;另外6个肢芽用于荧光定量 PCR (Quantitative Real-Time PCR,QRT-PCR)分析,检测 Hspb 10表达情况。结果:荧光显微镜下,在各时点,两组的肢芽均有绿色荧光,提示绿色荧光蛋白(GFP) 表达质粒、siRNA 成功导入肢芽中;实验组各时间点肢芽和相应对照组肢芽均无形态异常,也无大小差异。自培养48小时起,实验组肢芽的骨骼发育异常。自培养6小时起, 实验组 Hspb10的表达低于对照组(P0.05)。结论:建立的小鼠肢芽体外培养与 RNAi 联合技术可作为一个研究肢发育过程中的基因功能的新方法;Hspb10可能参与了小鼠肢骨骼的发育。

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1 朱勇飞;朱江波;万旭英;朱玉平;张天宝;;组织特异性RNA干扰与小鼠肢芽体外培养联合技术的研究(摘要)[A];中国毒理学会第二届全国中青年学者科技论坛会议论文集[C];2007年
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