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《2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集》2005年
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堆肥未培养微生物宏基因组文库的构建及纤维素酶基因的克隆、表达及产物鉴定

庞浩  段承杰  封毅  张鹏  许跃强  赵广存  唐纪良  冯家勋  
【摘要】:从环境微生物Metagenome文库中克隆基因是一个有效的获取新基因的途径。由于堆肥含有大量的腐殖酸及各种杂质,因而利用堆肥材料构建Metagenome 文库是一个大难题。我们通过联合使用PVPP 柱纯化和电洗脱的方法获得纯度适合用于构建柯斯质粒文库的总DNA,并构建成含有100 000个克隆的堆肥metagenome 柯斯文库。在文库中筛选到4个表达内切纤维素酶活力的克隆1个表达葡萄糖苷酶活力的克隆。这5个基因的DNA 序列与GenBank 数据库中的核酸序列没有同源性,而5个推定蛋白质与Xanthomonas 属中菌株的纤维素酶有最高的相似性。在对其中3个推定的家族9的CMCase 蛋白质进化树分析中发现,3个蛋白质都和一个在埃及碱性湖中发现的内切纤维素酶有极大的亲缘关系。我们对其中的2个编码家族9 CMCase 的基因进行表达以及表达产物纯化和鉴定。UMCEL9A 的最适pH 值为6.5、最适温度为40℃;UMCEL9B 的最适pH 值为7.0、最适温度为45℃。这2个酶都能耐受碱性条件,在pH10.0的条件下保存24h,活力没有显著下降。Umcel9A 和Umcel9B 的Vmax 值分别是529.1μmol·min·mg 和130μmol·min·mg,Km 分别是4.193 mg/ml 和8.332 mg/ml。

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