【摘要】：正生长激素释放激素(GHRH)和生长激素释放抑制因子(SS或GHRIH)是生长激素(GH)的正、负调控因子,表达GHRH的同时免疫中和SS,完成对GH的双向调节(增强正调节作用、减弱负调节作用),在理论上具有更好的生长调控作用。试验根据RNA复制子真核表达载体(pCMV-repLacZ)的特点,选择LacZ基因两端的BamH I作为外源基因插入位点,利用BamH I和BgLII互为同尾酶,设计GHRH引物,序列如下:引物1:5、CGGAATTCATGCTGCTCTGGGTGTTC3';引物2: 5、GAAGATCTTTACCCCTGCTGCCTGCTTAT3'。以本室构建的pIRES-GHRH-HBsAg-SS为模板,扩增 GHRH基因片段,用EocR I和BgLII酶消化后,与pIRES-GHRH的EocR I和BamH I酶切大片段用 T4连接酶连接,之后转化大肠杆菌DH5 α感受态,经酶切、PCR及测序鉴定。鉴定正确后,合成含有 BamH I酶切位点GHRH5'端引物,以及含有BamH I酶切位点HBsAg-SS3'端引物,引物序列如下: 引物1:5'CGGGATCCATGCTGCTCTGGGTGTTC3';引物2:5'CGGGATCCCTAACAGGATGTGAAA3'。以已经改造过的pIRES-GHRH-HBsAg-SS为模板,扩增双基因片段,扩增产物经纯化连接到pGEM-T 载体上,经酶切、PCR及测序正确后,用BamH I酶切重组质粒,得到两端含有BamH I黏性末端的 GHRH-HBsAg-SS目的片段,同时用BamH I酶切pCMV-rep-LacZ,得到载体大片段,用碱性磷酸酶去磷酸化后,与目的片段用T4连接酶连接,电转化至大肠杆菌DH10B感受态,蓝白斑筛选重组质粒,经酶切,PCR, 方向鉴定正确后, 获得重组质粒pCMV-rep-GHRH-HBsAg-SS。将 pCMV-rep-GHRH-HBsAg-SS转染BHK细胞,提取细胞总RNA,进行RT-PCR,检测结果证明质粒成功转染细胞,并转录正确;回收细胞培养上清液,经Tricine-SDS-PAGE,Dot-blot,Western Blotting, 间接ELISA检测到目的蛋白表达。本试验构建了基于RNA复制子的GHRH和SS双基因真核表达载体 pCMV-rep-GHRH-HBsAg-SS,并成功地实现了在细胞中的表达,这为下一步GH双向调节基因表达系统的研究打下基础。