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基因工程法构建透明质酸生产菌株

生举证  朱希强  凌沛学  郭学平  张天民  
【摘要】:透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种高分子量的黏多糖,广泛存在于脊椎动物细胞中,发挥着结构、信号传导和信号识别的功能。HA由于其优异的黏弹性、保湿性和支撑作用,被广泛的应用于医药、化妆品、药物传递系统、疫苗和功能健康食品。目前,工业上主要经由革兰氏阳性C型链球菌如兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)发酵生产。但作为生产菌株,链球菌生长速度慢、培养基成本高等劣势日益显现出来,而寻找新的优秀野生生产菌株的希望渺茫。所以,利用基因工程构建合成HA的工程菌株不但有利于克服链球菌作为发酵生产HA菌株的劣势,而且对提高HA的品质,扩大HA的应用范围具有理论意义和应用价值。本研究分别将基因szHasA、szHasB和szHasC的ORF重组于NICE表达载体pNZ8148的PnisA启动子调控之下,得到含有pSH71来源复制起始位点的表达载体pNZ8148-szHasA、pNZ8148-szHasB和pNZ8148-szHasC。通过重组表达载体pNZ8148-szHasABC和pNZ8149-szHasABC将兽疫链球菌来源的HA合成操纵子分别导入乳酸乳球菌NZ9000和NZ3900,得到工程菌株NFHA01和NFHA03。同时,通过融合PCR方法得到一个重组HA合成操纵子,命名为rHAop,在该DNA片断中,原兽疫链球菌HA合成操纵子中的szHasB和szHasC基因的ORF分别被乳酸乳球菌来源的ugd和LACR基因的ORF所取代。重组HA合成操纵子rHAop通过重组表达载体pNZ8149-rHAop导入乳酸乳球菌NZ3900中,得到工程菌株NFHA03。RIA法测定各工程菌株诱导后发酵液中HA的浓度。空白对照菌株NZ9000和分别单独表达szHasB、szHasC的工程菌株NZ9000-B和NZ9000-C的发酵液中没有检测到HA的合成,而工程菌株NZ9000-A发酵液中含有0.22 g/L的HA。证明乳酸乳球菌本身不具有合成HA的能力,而在该菌中单独表达HAS可以使工程菌株获得合成HA的能力,而且该菌本身具有HA底物UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的合成途径。工程菌株NFHA01的发酵液中含有0.6g/L的HA,这一数据约为NZ9000-A发酵液中HA浓度的2.7倍,这一结果证明虽然乳酸乳球菌具有合成UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的能力,但自身合成的HA底物的不足限制HAS在工程菌株中合成高浓度的HA,而提高工程菌株HA底物的浓度,有助于HA合成能力的提高。工程菌株NFHA03和NFHA02发酵液中HA的浓度分别为0.49 g/L和0.38 g/L,前者大约高出后者33%。证明在乳酸乳球菌工程菌株中重组表达异源szHasA,同时超表达同源UDP-GlcDH和LACR较同时表达外源szHasA、szHasB和szHasC更利于HA的合成。本论文利用lacF基因作为食品级筛选标记和NICE表达系统,构建得到一株不产生荚膜的具有食品级HA合成能力的工程菌株,而食品级HA在保健食品、医药产品和化妆品的应用中具有明显的优势。

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