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《“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要》2009年
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Ca~(2+)/CaM调节平滑肌肌球蛋白轻链激酶非激酶活性研究

张月  赵莹  崔颖  魏晓晴  高颖  
【摘要】:肌球蛋白轻链激酶(MLCK)在有Ca~(2+)与钙调蛋白(Ca~(2+)/CaM)存在的情况下磷酸化肌球蛋白20KD调节轻链,从而使肌球蛋白与肌动蛋白之间相互作用。此外,MLCK还具有非激酶活性,在用肌球蛋白包被的盖玻片上我们观察到MLCK可以抑制ATP依赖的肌动蛋白丝的运动。本实验中我们通过对MLCK的CaM结合位点进行定点突变使其失去激酶活性,获得的重组MLCK称之为△CaM/MLCK,并利用大肠杆菌表达系统成功地进行了大量表达。检测了重组△CaM/MLCK突变体对肌球蛋白的Mg~(2+)-ATP酶活性的影响,又通过体外结合实验检测了Ca~(2+)/CaM对重组MLCK与肌动蛋白结合活性的影响,我们还通过体外肌丝运动实验(in vitro motility assay)检测了重组MLCK对肌动蛋白丝运动速度的影响。结果表明:△CaM/MLCK具有在无Ca~(2+)/CaM条件下,激活非磷酸化肌球蛋白的Mg~(2+)-ATP酶活性,抑制磷酸化肌球蛋白的Mg~(2+)-ATP酶活性;结合实验结果显示,重组野生型MLCK(WT/MLCK)和△CaM/MLCK都具有与肌动蛋白结合的活性,Ca~(2+)/CaM可以部分抑制WT/MLCK与肌动蛋白的结合(p0.05),却对△CaM/MLCK与肌动蛋白的结合没有明显的抑制作用;体外肌丝运动实验结果显示,在无Ca~(2+)/CaM条件下,WT/MLCK和△CaM/MLCK都具有抑制肌动蛋白丝的运动(p0.01),在有Ca~(2+)/CaM条件下,随着WT/MLCK浓度的增加对肌动蛋白丝的运动并没有抑制作用,而△CaM/MLCK却有明显的抑制作用(p0.01)。以上结果显示,MLCK的非激酶活性在平滑肌的收缩过程中起着非常重要的作用。

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