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南极衣藻γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)基因的克隆,原核表达及定量分析

彭跃跃  丁燏  简纪常  鲁义善  
【摘要】:本实验应用RT-PCR以及Race PCR技术克隆到ICE-L GSHI全长。ICE-L GSH I全长2199bp,包含36bp的5′非编码区(UTR)和1029bp的3′UTR;开放阅读框(ORF)1452bp,编码483个AA,终止密码子为TAA,预测分子量计算值(MW)为55.178kD,理论等电点(PI)为5.97。BLAST分析与莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii线粒体GSHI(XM 001701595)同源性最高,一致性达到69.98%。其它软件分析:无N端信号肽序列、无跨膜区、无N-糖基化位点、27个磷酸化位点:包括15个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点和15个酪氨酸磷酸化位点、蛋白质亚细胞定位预测ICE-L GSHI基因可能来源于线粒体。同时,对GSHI进行了原核表达和western blot分析,结果均显示都在56kDa左右有条带,与预测大小相符。最优表达条件为:IPTG浓度0.2mmol/L,37℃诱导3 h;且表达的蛋白以包涵体的形式存在。荧光定量PCR技术结果显示:ICE-L GSH I基因具有一定的抗盐和抗寒性。

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