大菱鲆红体病虹彩病毒基因组分析和分子流行病学研究

【摘要】：大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国北方沿海地区主要的海水养殖鱼类,大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是我国工厂化养殖大菱鲆的主要病毒性病原之一。本研究测定了TRBIV的基因组全序列,结果表明该病毒为双链DNA病毒,长度为110104 bp,G+C含量为55%。生物信息学分析发现,TRBIV的基因组中存在115个潜在的ORFs,编码长度从40到1168个氨基酸残基不等。这115个ORFs包含了虹彩病毒科病毒的26个主要基因,共覆盖了TRBIV基因组92%的区域,其中56.5%的ORFs为正向编码,43.5%的ORFs为反向编码。TRBIV基因组在23512～23762 bp处存在大量的多倍重叠、交叉串联的直接重复序列,总长度为251 bp。通过对TRBIV的主要结构和功能基因如主要衣壳蛋白(MCP)基因、腺苷三磷酸酶(ATPase)基因、核苷酸还原酶小亚基(RNRS)基因、DNA指导的DNA聚合酶(DdDP)基因及其推测蛋白的氨基酸序列的分析和比对,构建了虹彩病毒系统进化树,结果显示TRBIV与虹彩病毒科细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)病毒关系最为相近,ORFs的氨基酸序列相似性介于95～99%之间。由此确认TRBIV隶属于细胞肿大病毒属,是该属的一个新成员。通过比较发现,在已经测序的细胞肿大病毒属虹彩病毒中,TRBIV基因组最小,ORFs数目最少。为了给TRBIV的分子流行病学研究、传播途径调查和疾病快速诊断提供技术手段,本研究依据TRBIV的MCP、ATPase和DdDP等基因序列设计了多对引物,建立了快速、准确、灵敏的TRBIV常规PCR、套式PCR和Real-time PCR检测方法。利用建立的常规PCR方法,可以从相当于100 ng病鱼组织中或103数量级的病毒粒子中检出TRBIV,也可以在不杀死被测鱼的情况下,仅从鱼体中抽取少量血液即可在1 d的时间内完成大量样品的TRBIV检测。利用建立的套式PCR检测方法,从无发病症状的半滑舌鳎、非洲黑石斑鱼等样品中检测到了TRBIV的存在,表明这两种海水养殖鱼类可能也是TRBIV的宿主之一。建立的Real-time PCR检测方法,可以对样品中的TRBIV进行定量分析,并检测到相当于102数量级的TRBIV基因组拷贝。应用建立的Real-time PCR检测方法,研究了TRBIV的组织敏感性,结果发现,大菱鲆的脾脏、肾脏、脑、鳃、心脏、肝脏、消化道、血液等组织中均可检测到TRBIV的存在,其中脾和肾是TRBIV的最主要的靶器官,每毫克组织的病毒含量分别高达5.23×106个和2.18×106个。开展的TRBIV分子流行病学调查结果显示,山东半岛的多个大菱鲆养殖场中均存在TRBIV的感染和流行,感染鱼每毫克脾组织的病毒含量在1.27×102～2.33×106之间。但自2003年以来山东半岛不同养殖地域、不同采集年代的TRBIV基因序列完全相同,没有发生变异。TRBIV已经在包括中国和韩国在内的东亚、东南亚地区广泛存在,今后需要密切关注该病毒的传播和流行。