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《2017年中国肿瘤标志物学术大会暨第十一届肿瘤标志物青年科学家论坛论文汇编》 2017年
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肝癌特异型GPC-3转录抑制对肝癌靶向治疗价值的研究

方淼  董志珍  王理  姚敏  邱历伟  张海健  姚登福  
【摘要】:目的新发现以糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜表面的癌胚型磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC-3)为肝细胞恶性转化的特异标志,它经调控Wnt信号通路,促进肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发生与转移;已证实沉默GPC-3基因转录可抑制肝癌细胞增殖,但能否成为HCC治疗的潜在靶点及分子机制有待阐明。本文分别以肝癌细胞和裸鼠皮下移植瘤模型,以特异性miRNA在转录水平下调GPC-3表达,观察对HCC细胞增殖和生长的影响,分析Wnt/β-catenin信号通路中关键分子表达并探讨其分子机制。方法以Western blotting检测肝癌(SMMC-7721、HepG2、Bel-7402、PLC/PRF/5、MHCC-97H、Hep3B和Bel-7404)细胞株GPC-3表达,选择高表达的细胞株用于后续研究;构建和筛选GPC-3-miRNA高效干扰质粒并测序鉴定,转染研究细胞株;以荧光定量聚合酶链反应评估干扰效率;以Western blotting分析GPC-3及Wnt/β-catenin通路关键分子表达;CCK-8法检测细胞增殖;平板克隆及软琼脂克隆形成实验分析细胞克隆形成及非锚着依赖性生长能力;流式细胞术分析细胞周期;以杀稻瘟菌素筛选GPC-3沉默的稳定转染细胞株,裸鼠皮下注射、成瘤;观察皮下肿瘤形成时间及大小,计算瘤体;经苏木精-伊红染色法检查,并以免疫组化分析组织GPC-3、β-catenin、p-GSK3β及CyclinD1表达。结果人肝癌SMMC-7721、MHCC-97H、Bel-7402、PLC/PRF/5、HepG2、Hep3B和Bel-7404细胞株中GPC-3差异表达,其中HepG2和Hep3B细胞强势表达。筛选已构建的四种p CMV-GPC-3-miRNA干扰质粒,以miRNA1效率最佳,在体外分别转染HepG2和Hep3B细胞,GPC-3在基因转录和蛋白水平上表达明显降低(P0.01),癌细胞增殖明显受抑并呈时间依赖性,无血清培养增强抑制效果(P0.01);干预组癌细胞平板克隆形成及软琼脂克隆形成能力均明显降低(P0.01);癌细胞增殖周期发生G1期阻滞,CyclinD1表达降低(P0.01);Wnt/β-catenin通路关键分子β-catenin (P0.01)及p-GSK3β表达降低(P0.01)。沉默GPC-3裸鼠皮下移植瘤形成潜伏期明显延长(P0.01),肿瘤生长速度明显慢于空白组,干预组差异最显著(65.48±13.66 mm3vs 404.83±52.63 mm3, t=15.29, P0.01)。移植瘤病理学检查示干预组癌细胞分界相对较清,排列呈条索状、板状,偶见细胞核固缩坏死样改变,胞膜较完整且明显。免疫组化证实干预组癌组织中GPC-3、β-catenin、p-GSK3β及CyclinD1表达均显著(P 0.01)低于空白组;阴性组和空白组间GPC-3、β-catenin、p-GSK3β和CyclinD1表达均未见明显差异。结论体内、外研究证实干预GPC-3基因转录可经Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞增殖或肝癌生长,提示GPC-3为潜在的HCC基因治疗的有效靶目标。

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