杨树转抗虫基因Bt和C4光合关键基因PEPC的研究

【摘要】：杨树是重要的速生用材树种之一,近年来我国杨树的栽培面积居世界首位,但大面积的人工造林,单一品种的过度利用导致病虫害愈演愈烈,基因工程技术的发展,为提高杨树生长量、增强抗病虫能力提供了一条有效途径。本研究以本实验室已有的转C4光合关键基因PEPC的南林895杨为试验材料,利用正选择标记系统中的甘露糖异构酶基因PMI为选择标记,开展转Bt抗虫基因的遗传转化研究。旨在为培育高产、多抗杨树新品种提供依据。主要研究进展如下:1、进一步完善了杨树转基因研究中安全选择标记甘露糖异构酶PMI基因筛选体系。经南林895杨对甘露糖敏感试验,分化筛选培养基为:分化培养基+甘露糖8g/l+蔗糖22g/l;芽伸长筛选培养基为:芽伸长培养基+甘露糖10g/l+蔗糖20g/l;生根筛选培养基为:生根培养基+甘露糖6g/l+蔗糖19g/l。2、利用建立的PMI选择标记转化系统,通过农杆菌介导法,开展对转PEPC基因南林895杨再转Bt抗虫基因的研究,共计获得抗性植株274个株系。与抗生素筛选系统比较,利用PMI选择标记系统杨树遗传转化效率大大提高,最高达17.57%,平均转化效率为12.82%。3、对获得的抗性植株进行分子检测,经PCR分析显示阳性的有57个株系,并对PCR阳性植株进行RT-PCR分析,结果表明57个株系中有8个株系外源基因获得了表达。选取培养40天左右的转基因试管苗置于温室,练苗3天后移栽至花盆中。4、采用杨小舟蛾健康四龄虫对RT-PCR检测阳性的4个株系进行室内饲虫试验,结果显示转基因株系表现出不同程度的抗虫性。其中PB2明显优于其他3个株系(PB27、PB43、PB86),用PB2株系叶片饲喂幼虫,校正死亡率约30%。饲喂转基因植株叶片对幼虫化蛹率产生显著影响,1～3龄幼虫的化蛹率分别为27.4%,33.1%,30.8%,与对照化蛹率(74.3%～87.7%)的差异极显著。转基因杨树叶片对幼虫体重有显著抑制作用,饲喂幼虫平均体重下降约40%。