舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆及鉴定

【摘要】：蛇毒是一种成分复杂的天然生物毒素,含有多种酶类和药理活性多肽,其中细胞毒素(CTX)在体外对多种瘤细胞具有直接溶解作用。从蛇毒中分离细胞毒素资源有限,成本高技术难,质量标准难统一,因此本研究探讨应用基因克隆的方法,构建CTX表达载体,在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素(CTX),测定N-末端及C-末端的氨基酸序列并据此设计引物,P1:5'-GGGGTACCAAAACTCTGCTGCTGACCTTG-3',P2:5'-CGAGCTCTCAGTTGCATCTGTCTGTATTG-3',RT-PCR扩增CTX cDNA。经Kpn I and Sac I双酶切,与克隆载体pET42α连接,获得重组DNA(CTX-pET42α),转化至大肠杆菌DH5α。单克隆(CTX-pET42α-DH5α)增殖后,抽提质粒,并用Kpn I and Sac I双酶切图谱分析、T7引物PCR和DNA序列测定,鉴定阳性转化子DNA序列,该序列与文献报导的蛇毒CTX基因序列一致;将鉴定确认的阳性转化子重组质粒(CTX-pET42α),应用CaCl_2法转化至表达菌E.coli BL21中,为开发应用眼镜蛇毒CTX,进行CTX的药学研究做准备。