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海洋真菌破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10△5脱饱和酶基因的克隆与表达

夏晓峰  于爱群  江贤章  黄建忠  
【摘要】:二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA,C22:6(ω-3))是一种具有重要生理功能的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids,PUFAs),具有抗心血管疾病、抗血脂、降血压、预防各种癌症等重要生理功能。海洋破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10是DHA的高产菌株,可作为研究高度不饱和脂肪酸生物合成的模式生物。为阐明其DHA生物合成机制及利用基因工程技术提高DHA生物合成的能力,本文利用RT-PCR技术从Thraustochytrids中扩增得到DHA生物合成途径中的△5脱饱和酶基因DSR5(Genebank Accession Number:EU643618),该基因由1320个核苷酸组成,共编码439个氨基酸,序列比对分析表明该酶前端的细胞色素B5区含有HPGG保守序列,脂肪酸脱饱和酶保守区含有三个经典的组氨酸盒,分别是位于171-175位的HXXHH,208-212位的HXXHH以及376-380位的QXXHH。疏水分析和跨膜分析的结果表明该酶是个疏水性蛋白,含有三个明显的跨膜区,其中N端在膜外,C端在膜内。进化树分析结果显示该酶属于delta5脱饱和酶,且与Thraustochytrium sp.ATCC21685菌株所编码的delta5脱饱和酶亲缘关系最近。为验证所克隆cDNA序列的功能,将DSR5连接到经HindⅢ/XbaⅠ酶切处理过的pYES2质粒,构建了delta5脱饱和酶重组表达载体PYD5,以尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVScl作为宿主进行功能表达分析,添加外源脂肪酸底物二高-γ-亚麻酸,20℃低温培养,半乳糖诱导,气相色谱分析结果显示转基因酵母合成了花生四烯酸(Arachidonic acid,AA,20:4(ω-6)),表明所克隆的基因具有△5-脂肪酸脱饱和酶的功能,能特异性地在DGLA的C5和C6位之间脱氢形成双键。

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