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卵形鲳鲹β-胸腺素基因的克隆及原核表达

王世锋  刘巧红  谢珍玉  郭伟良  蔡岩  周永灿  
【摘要】:卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国海南、广东和广西等南方沿海地区重要的海水养殖鱼类,本文利用同源基因克隆,同时结合RACE-PCR技术,首次克隆得到卵形鲳鲹β-胸腺素cDNA全长序列。该基因序列全长为605bp,包括5’端非编码区76bp,3’端非编码区394bp含加尾信号(AATAA)及ployA尾,以及135bp的开放阅读框。该基因开放阅读框共编码44个氨基酸,预测编码的蛋白分子量为5.02kD,理论等电点为4.93,蛋白结构预测含有β-胸腺素肌动蛋白结合区。利用荧光定量PCR对β-胸腺素基因在卵形鲳鲹中的表达量进行了分析,结果表明,该基因在各个组织中均有表达,其中在肠道、脾脏、头肾等免疫相关器官中的表达量最高。同时利用插入酶切位点的引物扩增该基因开放阅读框序列,将扩增得到的目的基因和PET-32a质粒经BamhⅠ和SalⅠ双酶切后连接构成重组质粒,转化入BL2-1表达菌株,利用IPTG诱导表达。为了提高表达效率,进行表达条件的优化,SDS-PAGE分析表明,在16℃下,利用0.5 mM IPTG诱导12h后表达量最高,表达产物分子量与预测值相符,重组融合蛋白主要以可溶性形式在上清中高效表达。利用Ni-Agarose His标签蛋白亲和柱进行纯化,得到较高纯度的融合蛋白。研究结果为深入研究β-胸腺素蛋白活性及卵形鲳鲹非特异性免疫机制等奠定了良好的基础。

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