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《2010年广东省药师周大会论文集》2011年
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何首乌叶cDNA文库的构建及EST分析

谭雪梅  申彦晶  严萍  郑传进  赵树进  
【摘要】:为进行药用植物次生代谢产物的生物合成基因调控研究,构建了何首乌cDNA文库。摘取三年生何首乌成熟叶片,提取其总RNA,纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,削平cDNA末端,连接EcoR I接头子,磷酸化EcoR I接头5'端,经Xho I酶切后,用Sepharose CL-2B凝胶介质过滤除去400bp以下的片段,与Uni-λZAP XR载体连接,包装蛋白包装后构建成cDNA文库。测定该初始文库滴度为1.07×106pfu/ml,含有5.4×105个重组子,插入片断长度为0.5~2.0kb。文库扩增的重组子为4.25×1011个,重组率为98.5%。随机挑取16个噬菌斑,经裂解后,用作PCR扩增模板,鉴定插入片段的大小范围和重组率;继续随机挑取12个噬菌斑,在ExAssist辅助噬菌体的作用下,释放出pBluescript SK-噬菌粒,感染大肠杆菌SOLR,铺于氨苄青霉素抗性平板;使用碱裂解法提取噬菌粒,经EcoR I和Xho I双酶切后,进一步确定片段的大小。随机挑取30个在抗性平板中生长的阳性克隆子,提取pBluescript SK-噬菌粒后,进行ESTs3'序列测定,结果超过70%的EST序列长度为500bp。结果显示,所构建的文库库容量满足基因筛选要求。所获得的何首乌叶cDNA文库和部分3'EST序列信息,可以作为植物基因组计划的重要补充,为中草药相关功能基因的研究奠定了基础。
【作者单位】:广州军区广州总医院 广东省药品检验所
【分类号】:S567.239

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