运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

【摘要】：一、研究意义和目的嗜热菌(Thermophilic bacteria)一般指在55℃以上能生长的微生物,它们大多生活在深海、火山口、温泉、堆肥等处。嗜热菌的研究热潮始于上世纪六七十年代。1969年T.D.Brock及其同事从美国黄石国家公园的温泉中分离到最适生长温度为70℃的水生栖热菌(Thermus aquaticus)至今,世界各国科学家不断地从陆地温泉和深海海底火山口等各种高温生态环境中分离出了上百种能在90℃以上温度中生存的细菌和古细菌,并采用先进的研究手段对这些高温菌的分类、生理、生化、生态、遗传、生物工程等进行了广泛深入的研究。其中最重要的一项研究表明,从这些嗜热微生物中分离的嗜热酶具有一些优良的生物学性质,尤其作为生物催化剂有许多优势:(1)酶制剂的成本降低,稳定性提高,可在室温下分离提纯和包装运输,并能长久的保持活性;(2)加快了动力学反应;(3)对反应的冷却系统要求降低,因而降低了能耗,既可降低成本,又可减少冷却过程对环境造成的污染;(4)在嗜热酶催化反应的条件下(超过60℃),很少有杂菌污染,从而减少了细菌代谢产物对产品的污染,可提高产物的纯度,简化其提纯过程;(5)生化过程在高温下进行能增加难溶物质如淀粉类、纤维素类、多芳香类和脂类等溶解性和可利用性,降低有机化合物的粘度而利于物质的扩散和混合。这些性质不仅可作为设计和改造酶类的依据,而且在工业生产中极具应用价值。由于以上原因,嗜热微生物、极端嗜热微生物及其产生的嗜热酶在食品、化工、制药和环保等方面有着广阔的应用前景。我们从广西贺州县西鸡村80℃温泉分离嗜热菌,一是研究广西的嗜热微生物资源,但更重要的是:(1)从极端环境中筛选出抗性更强、酶活更高的嗜热酶生产菌株;(2)采用分子生物学手段,将嗜热酶基因导人中温型生物中高效表达。目前该方面的研究已取得了很好的进展,是一种行之有效的方法。二、项目内容和结果从广西贺州县西鸡村80℃温泉分离了一株嗜热菌,经16S rRNA鉴定该菌为栖热菌属(Thermus)的一株。从形态学来看,该嗜热菌杆状,革兰氏阴性,无鞭毛和内生孢子。在琼脂平板上成圆形、表面扁平的黄褐色菌落,表面光滑有光泽。专性需氧,琼脂穿刺培养只在表面生长。可利用的碳源有葡萄糖、甘油、α—乳糖、蔗糖、菊糖、麦芽糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、D—松三糖。自D—果糖、D—木糖、纤维二糖、L—鼠李糖、乳糖、D—半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、α—乳糖、海藻糖、淀粉、蕈糖、菊糖产酸。脂酶和产氨试验为阳性,其它生理生化反应均为阴性。在75℃最适pH7.0,低于pH 5.5或高于pH 8.5均不生长。在复合胨—酵母膏培养基中,NaCl最适浓度为0.2%～0.5%,1%NaCl下生长贫乏。最适温度70℃～75℃,最低50℃,最高85℃温度:55℃以下和80℃以上生长贫乏而缓慢。并发现该菌产海藻糖合成酶,现正试图用分子生物学的手段克隆该基因的全序列,并在大肠杆菌中进行表达。