脱蛋白骨复合转染VEGF基因骨髓基质细胞治疗股骨头缺血坏死的实验研究

【摘要】：第一部分狗骨髓基质细胞体外诱导成骨潜能研究目的:观察狗骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法:采用双侧髂骨取材进行骨髓基质细胞培养,观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果:骨髓基质细胞呈成纤维样表现,增殖力强。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性明显增高,骨钙素与Ⅰ胶原表达增多,10-12达到高峰,并出现矿化结节。结论:狗骨髓基质细胞在本实验条件下,其成骨能力肯定,增殖能力强,可作为骨组织工程的种子细胞。第二部分VEGF165基因转染狗骨髓基质细胞的体外生物学特性研究目的:探讨VEGF165基因转染狗骨髓基质细胞的体外生物学特性。方法:将重组的VEGF165基因用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞,用免疫组化及RT-PCR方法检测VEGF的表达;观察细胞形态特征,通过四唑盐(MTT)检测转染对细胞增殖的影响;通过对硝基苯磷酸盐(PNP)检测ALP的活性;放免法检测骨钙素的分泌;考马斯亮蓝法检测蛋白质含量;透射电镜观察细胞超微结构。结果:重组质粒pcDNA3-hVEGF165转染骨髓基质细胞后,免疫组化及RT-PCR方法检测有VEGF表达;骨髓基质细胞转染基因后,具有成骨细胞的结构特征和生物学特性,且细胞的增殖能力有明显增强;转染细胞ALP活性增高,骨钙素分泌增多;透射电镜可见转基因细胞内质网增多,线粒体致密,而糖原溶解与脂肪空泡则减少。结论:VEGF基因转染可促进骨髓基质细胞的成骨分化。第三部分脱蛋白异体骨复合转染VEGF基因的骨髓基质细胞培养的生物相容性研究目的:探讨自制的脱蛋白异体骨与转染VEGF基因骨髓细胞的生物相容性。方法:将经物理与化学方法处理而制得的脱蛋白骨与骨髓基质细胞复合培养,形态学观察、细胞增殖、ALP的活性、骨钙素的分泌与蛋白质含量检测;扫描电镜观察细胞在脱蛋白骨材料上的情况。结果:转染VEGF基因骨髓细胞能在脱蛋白骨上贴附、增殖,其生长及功能不受影响。结论:自制的脱蛋白骨与骨髓基质细胞具有良好的生物相容性,可作为骨髓基质细胞的载体应用于骨组织工程。第四部分脱蛋白异体骨复合转染VEGF165基因的骨髓基质细胞在裸鼠体内的成骨研究目的:探讨脱蛋白骨支架复合转染VFGF165基因的骨髓基质细胞体内植入的成骨作用。方法:将自制的脱蛋白骨分别与转染基因狗骨髓基质细胞未转基因的骨髓基质细胞复合培养后植入裸鼠背部肌肉内为实验组,以单纯材料植入为对照组,经大体观察与形态学检查细胞一材料复合植入的成骨作用结果:组织学检查两实验组均有成骨,并随时间延长而新骨增多,但其中转基因组在3组内有VFGF表达,其成骨作用明显,血管生成较多;对照组无成骨现象。结论:复合转染VEGF基因骨髓基质细胞的脱蛋白骨具有较好的成骨作用。第五部分脱蛋白异体骨复合转染VEGF基因的自体骨髓基质细胞治疗股骨头缺血坏死目的:探索治疗股骨头缺血坏死的新方法。方法:将转染pCD-hVEGF165质粒的自体骨髓基质细胞与脱蛋白骨复合培养后植入缺血坏死的狗股骨头内,用免疫组化方法检测VEGF的表达,以做循环灌注方法了解股骨头内的血运情况,通过组织形态学观察坏死股骨头的修复情况,骨密度仪测定股骨头的骨密度。结果:植入3周后免疫组化证实植入转基因细胞复合物组股骨头内有人VEGF表达,股骨头内有大量的树枝状血管生成,股骨头修复明显快于其它对照组,而且至术后第9周时其骨密度显著增加。结论:利用自体骨髓基质细胞传染VEGF基因可有效促进缺血坏死骨内的血管再生,改善骨内微循环,有利于促进坏死骨的修复,为临床治疗股骨头缺血坏死研究提供了新的治疗方法。