薄壳山核桃MADS-box类转录因子基因CiAG的克隆与功能分析

【摘要】：从薄壳山核桃中克隆到花发育相关的MADS-box类转录因子基因CiAG,研究其在薄壳山核桃3个品种不同组织中的表达特性,并通过转基因拟南芥验证基因功能,为今后通过基因工程技术手段改良薄壳山核桃品种奠定理论基础。试验材料为3个薄壳山核桃品种‘绍兴'、‘波尼'和‘马罕'。在生长季采集不同组织,包括叶片、当年生枝条、雌花、雄花、幼果。利用同源克隆的方法从‘马罕'雄花中克隆MADS-box类转录因子基因CiAG;利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析该基因在3个品种不同组织中的表达特性;构建植物表达载体,转化模式植物拟南芥,对拟南芥进行抗生素筛选,获得T2代转基因株系,利用RT-PCR技术进行分子检测,并对其表型进行观察,验证该基因的功能。通过同源克隆的方法,获得基因片段为1 013 bp,开放阅读框长度为684 bp,编码227个氨基酸。将克隆得到的序列在NCBI上进行Blast比对,与榛子ChMADS1、黑樱桃PsAG、麻风树JcAG的同源性分别为88%、83%、83%,将克隆到的基因命名为CiAG。多序列比对结果显示,该基因包括高度保守的M区(2~57)、Ⅰ区(58~90),半保守的K区(91~173),C区(174~227),并在C结构域具有两个保守的AAGⅠ和AGⅡ基序。系统进化树显示,CiAG与拟南芥AG-like基因聚为一支,属于AG亚家族中euAG进化系。CiAG基因在3个品种中均有表达,在生殖器官(雄花、雌花、幼果)中的表达量显著高于营养器官(叶片、枝条),说明该基因在花发育过程起着重要作用。转基因拟南芥营养体长势弱,开花比野生型植株早,有的在4片基生叶出现时已经开花,其基生叶及茎生叶多小而卷曲。野生型拟南芥在其花发育的第11个时期,花苞未开,柱头的乳状凸起刚形成时看不到柱头,但同一时期的转基因拟南芥的柱头已经伸出花苞。转基因植株的花萼较短,未能全包住花蕾,表现出开花较早。转基因植株4个强雄蕊的长度均大于花萼花瓣的长度,野生型雄蕊的长度低于花瓣长度。在花器官发育的后期,转基因拟南芥第2轮花器官发生同源异型改变,花瓣基部收缩,花瓣雄蕊化。