库尔勒香梨MYB基因启动子的克隆与序列分析

【摘要】：启动子序列除含有基本元件TATA-box和CAAT-box外,还存在一些特异性的顺式作用元件,它们可以和转录因子等调节蛋白质协同作用。克隆启动子序列并对其中的转录因子结合位点进行分析是了解基因转录表达模式及其调控机制的关键。本研究前期从库尔勒香梨中分离出一个与脱萼宿萼相关的MYB转录因子基因KfpMYB。为研究KfpMYB的表达调控模式,本研究中分离出KfpMYB的启动子片段并进行生物学分析。以库尔勒香梨花为材料,提取基因组DNA,以基因组DNA为模板,用Primer Premier 5.0软件设计引物,由华大基因股份有限公司合成,上游引物为5′-AGGGTCCGCCACCGTCCTTCAC-3′,下游引物为5'-TGGCGAAGTATTATCGAATCCTGC-3′,扩增库尔勒香梨MYB基因KfpMYB上游约2 000bp的序列。PCR反应体系为:10×LA PCR BufferⅡ(Mg~(2+)Plus)2.5μL,dNTP Mixture(2.5mmol·L~(-1))4μL,模板1μL,上下游引物(20μmol·L~(-1))1μL,LA Taq酶(5 U·μL~(-1))0.25μL,加灭菌蒸馏水至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s;60℃退火45 s;72℃延伸2 min;35个循环;72℃终延伸7 min。将PCR扩增片段连接到pMD19-T克隆载体上,获得重组质粒并进行测序。测序结果利用DNAMAN软件进行比对,PLACE和PlantCare数据库用于启动子顺式作用元件的预测分析。克隆测序获得了KfpMYB基因启动子序列,分析结果表明,序列中存在大多数启动子的基本转录元件TATA-box和CAAT-box,并分布在多个位点上。另外还发现了一些顺式调控元件,如高转录水平调控元件5'UTR Pv-rich stretch,光调控相关元件——10PEHVPSBD、GATABOX、IBOXCORE、SORLIP1AT和TBOXATGAPB,胁迫相关元件CURECORECR,花粉基因特异性表达相关元件POLLEN1LELAT52,低温响应元件LTRE1HVBLT49和LTRECOREATCOR15。还有一些与激素调节相关的元件,如脱落酸响应顺式作用元件EBOXBNNAPA、LTRECOREATCOR15,赤霉素相关调控元件WRKY71OS、GARE-motif和TATC-box,生长素诱导有关元件NTBBF1ARROLB、TGA-element。此外,该启动子还含有MYB结合位点MBS,水杨酸响应元件WBOXATNPR1、TCA-element,植保素合成有关元件MYBCORE等。这些调控元件的存在说明KfpMYB基因受到多种元件的调控,而且该基因的表达与脱落酸、赤霉素和生长素等激素的调控有一定的关系。